本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一种提高普伐他汀发酵产量的方法。
背景技术：
普伐他汀是3-羟基3-甲基戊二酰辅酶a还原酶抑制剂，最初用于治疗高血脂症和家族性高胆固醇，后来适应症不断扩大，可以减缓动脉粥样硬化的发展，减少冠状动脉粥样硬化病变和临床心血管事件的发生。长期服用普伐他汀，无论病人是否患有冠心病，都能减低各种原因所致的死亡率，因此，普伐他汀成为目前他汀类药物中仅有的可用于胆固醇水平较高的或者冠心病的病人进行心脏病、中风一级和二级防御的药物。也有研究显示，普伐他汀还能降低糖尿病和阿尔茨海默病的发生率；能抑制肝癌细胞的增殖；能有效地治疗溃疡性结肠炎，副作用少，半年复发率低；在治疗慢性心力衰竭、舒张性心力衰竭方面，可改善心功能，改善心室重塑。
普伐他汀的生产通常由两步发酵过程获得，虽然也有报道或专利(wo99/10499、wo2007/147827、us6,274,360和ep1,266,967)描述可用一步发酵的方法生产获得普伐他汀，但由于技术复杂及生产效率等原因，普伐他汀的工业化生产仍以两步发酵为主。普伐他汀的两步发酵过程为：首先，通过桔青霉(penicilliumcitrinum)等微生物发酵生产获得其次级代谢产物美伐他汀mevastatin(又名康百汀compactin)，然后，通过微生物酶的转化作用，将美伐他汀转化为普伐他汀。
现有的专利或文献资料公开的将美伐他汀转化为普伐他汀的微生物主要包括以下几类：丝状霉菌(mortierellamaculata，wo00/46175)、根毛霉菌(mucorrhizopus，us4448979)、诺卡氏菌(norcardia，us5830695)、马杜拉放线菌(actinomadura，wo96/40863)、链霉菌(streptomycescarbopilusep215665)、脱叶链霉菌(streptomycesexfoliates，wo98/45410)和粉白小多孢菌(micropolysporaroseoalba，cn03141475a)等。
按照公开的专利，上述的霉菌、丝状细菌、放线菌和链霉菌均可以将美伐他汀转化成普伐他汀。然而，由于美伐他汀对微生物转化菌的毒害作用，使得微生物不能耐受添加到培养物中的甚至是低浓度的美伐他汀。现有技术下微生物转化菌对底物美伐他汀的耐受浓度为0.01-0.05％。
尽管李周灵等(wo98/45410)获得的脱叶链霉菌yj-118表现了较高(0.1-0.5％)的底物抗性，metkinen(metkinennewsmarch2000，metkinenoy，finland；reviewedbymanzoniandrollini，2002，applmicrobiolbiotechnol58：555-564)也获得了对3g/l美伐他汀具有抗性的streptomyces突变菌株，但其普伐他汀产率不高。
wo96/40863公开了马杜拉放线菌(actinomadura)atcc55678转化美伐他汀生产普伐他汀的方法，中国专利cn102757986b公开了以马杜拉放线菌为转化菌，在发酵过程中使用微量元素溶液以提高普伐他汀产量的方法，同时也研究了发酵培养过程中分别控制菌体增殖培养温度和美伐他汀转化温度对普伐他汀产量提高的有益作用。但两者均未提及麸皮浸汁在其中的应用，也未提及麸皮浸汁对普伐他汀产量提高的有益作用。
目前，普伐他汀发酵生产水平大多在15g/l左右，作为商业应用的规模生产，这样的生产水平仍有较大的提高空间。
对于二步发酵法生产普伐他汀来说，其第二步由微生物转化美伐他汀为普伐他汀是影响普伐他汀产量的关键性步骤，而在这一步中，如何提高微生物对底物美伐他汀的转化能力和普伐他汀发酵水平是降低普伐他汀生产成本、增加普伐他汀产量以提高经济效益的最有效途径。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种在发酵培养基中添加麸皮浸汁来提高普伐他汀产量的方法。现有工艺中普伐他汀产量较低，为了克服这个缺陷，本发明人对整个工艺中的多项参数进行了研究，如种子培养中培养基配方和培养条件、发酵培养中培养基配方和培养条件等，最终发现，向发酵培养基中加入麸皮浸汁，可提高马杜拉放线菌对美伐他汀的耐受性和转化能力，提高普伐他汀的发酵水平，从而提高普伐他汀的产量。
本发明提供的一种提高普伐他汀发酵产量的方法，是以美伐他汀为发酵底物，在发酵培养基中添加麸皮浸汁，通过马杜拉放线菌发酵生产普伐他汀。
在本发明的技术方案中，所述麸皮是小麦加工面粉后得到的副产品。过去，麸皮主要是用作饲料，经济价值不高。实际上，麸皮含有大量微生物生长必需的营养成分，如硫胺素、核黄素、尼克酸等微生物生长必需的生长素，还含有a-淀粉酶、β-淀粉酶、氧化酶、过氧化酶等微生物生长所必需的酶类。且据现代科研测定，麸皮中对氨基苯甲酸含量是植物中最高的，对氨基苯甲酸是细胞分裂必需物质。
本发明所述的发酵培养基的配方为：葡萄糖56-58g/l、酵母提取物22-24g/l、大豆蛋白胨6-7g/l、k2hpo4·3h2o1-2g/l、mgso4·7h2o0.5-1g/l、(nh4)2so41-2g/l、麸皮浸汁2.0-10.0ml/l和消沫剂0.5-1.0g/l，以水配制。
优选地，发酵培养基中，麸皮浸汁3-8ml/l。
最优选地，发酵培养基中，麸皮浸汁5.0ml/l。
本发明所用的消沫剂为本领域公知常用的消沫剂，本发明实施例中采用的消沫剂为硅醚消沫剂。
所述麸皮浸汁的制备方法为：取麸皮，加入其重量10～15倍量的水，浸泡2-8h，然后加热，回流提取1h，过滤滤液即得麸皮浸汁。过滤可使用但不限于多层纱布过滤。
进一步地，本发明的提高普伐他汀发酵产量的方法中，发酵温度始终控制为30-34℃。
优选地，发酵温度为30-32℃。
本发明的提高普伐他汀发酵产量的方法中，自美伐他汀加入已接种马杜拉放线菌的发酵培养基开始发酵起，控制美伐他汀在发酵液中的浓度为0.6-1.0g/l，持续时间为125-145h，然后停止补加美伐他汀，继续发酵12-20h后结束发酵。
优选地，自美伐他汀加入已接种马杜拉放线菌的发酵培养基开始发酵起，控制美伐他汀在发酵液中的浓度为0.8-1.0g/l，持续时间为130-145h，然后停止补加美伐他汀，继续发酵12-16h后结束发酵。
本发明提供了麸皮浸汁在提高普伐他汀发酵产量中的应用。
所述的应用，用马杜拉放线菌发酵美伐他汀的发酵培养基中麸皮浸汁浓度为2-10g/l。
具体地，所述发酵培养基的具体配方为葡萄糖56-58g/l、酵母提取物22-24g/l、大豆蛋白胨6-7g/l、k2hpo4·3h2o1-2g/l、mgso4·7h2o0.5-1g/l、(nh4)2so41-2g/l、麸皮浸汁2.0-10.0ml/l和消沫剂1.0g/l，以水配制。
在本发明的实施例中，具体步骤如下所示：
步骤1种子培养：首先按照如下配方配制种子培养基：葡萄糖28g/l、酵母提取物22g/l、大豆蛋白胨7g/l、k2hpo4·3h2o1g/l、mgso4·7h2o1g/l；向上述种子培养基中接种马杜拉放线菌，接种后在32～34℃下培养60小时；
步骤2发酵培养：首先按照如下配方配制发酵培养基：葡萄糖56～58g/l、酵母提取物22～24g/l、大豆蛋白胨6～7g/l、k2hpo4·3h2o1～2g/l、mgso4·7h2o0.5～1g/l、(nh4)2so41～2g/l、麸皮浸汁5.0ml/l和消沫剂1.0g/l；向发酵培养基中接种经步骤1种子培养后的马杜拉放线菌，接种后先在32～34℃下培养30～40小时，然后调节发酵培养基温度为30～32℃后补入美伐他汀溶液，30～32℃下培养146～159小时，培养过程控制美伐他汀在发酵液中的浓度为0.8～1.0g/l。发酵培养结束后，检测普伐他汀和美伐他汀的含量，结果发现美伐他汀的转化率达74％以上，普伐他汀发酵生产水平达18g/l以上。与现有技术相比，生产水平提高幅度达20％以上，转化率提高达10％以上，由此说明本发明的发酵工艺可大幅度提高普伐他汀生产效率及其产量。
上述发酵工艺中，种子培养基和发酵培养基中所用到的葡萄糖、酵母提取物、大豆蛋白胨为本领域技术人员进行培养基配制时所常用的碳源和氮源成分，本领域技术人员在实现本发明时只需购买市售的培养基配制时常用的葡萄糖、酵母提取物和大豆蛋白胨即可实现本发明；本发明的种子培养操作和参数均采用现有技术即可；本发明的发酵培养除了培养基中加入的麸皮浸汁，其余操作和参数均采用现有技术即可。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)发明人发现麸皮浸汁对马杜拉放线菌有很好的促生长作用，能够提高马杜拉放线菌对美伐他汀的耐受性(美伐他汀在发酵液中的浓度可达0.8～1.0g/l，比现有技术提高约0.2g/l)，同时提高马杜拉放线菌对美伐他汀的转化能力(发酵培养结束，美伐他汀转化率达到74％以上)和普伐他汀发酵水平(发酵培养结束，普伐他汀含量达到18g/l以上)，从而提高普伐他汀产量，降低生产成本。
(2)本发明的发酵工艺操作简便、成本低廉，适合于大规模的生产。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，实施例中，加入各原料除特别说明外，均为市售。
本发明的马杜拉放线菌(actinomadura)采用任何一种现有公开文献中，可将美伐他汀转化为普伐他汀的马杜拉放线菌属的菌种，均可实现本发明。
下述实施例中，普伐他汀和美伐他汀含量按照韩明活等.《hplc法测定普伐他汀生产样品中相关组分的含量》.今日药学.2010，20(7)的方法进行检测。本发明的实施例中，美伐他汀的转化率以下述公式进行计算：转化率＝普伐他汀获得量÷美伐他汀使用量×100％。
实施例1用马杜拉放线菌转化美伐他汀生产普伐他汀的发酵方法
本实施例的麸皮浸汁是按如下方法制备的：取麸皮，加入其重量15倍量的水，浸泡4h，然后加热，回流提取1h，使用6层纱布过滤，得到麸皮浸汁。
1、步骤1种子培养：
首先按照如下配方以1l摇瓶配制350ml种子培养基：葡萄糖28g/l、酵母提取物22g/l、大豆蛋白胨7g/l、k2hpo4·3h2o1g/l、mgso4·7h2o1g/l和消沫剂1g/l。
种子培养基灭菌后接入斜面种子马杜拉放线菌(actinomadura)，在32～34℃下摇床培养60h。
2、步骤2发酵培养
首先按照如下配方以5l全自动发酵罐配制3l发酵培养基：葡萄糖56g/l，酵母提取物22g/l，大豆蛋白胨7g/l，k2hpo4·3h2o1g/l，mgso4·7h2o1g/l，(nh4)2so41g/l，麸皮浸汁5.0ml/l，消沫剂1g/l。
发酵培养基灭菌后接入300ml种子液，在32～34℃下增殖培养40小时，调节发酵温度为30～32℃并在微生物转化美伐他汀过程保持此温度，补入美伐他汀溶液，以hplc法检测美伐他汀浓度使其维持在0.8～1.0g/l，培养至170h后停止补加美伐他汀溶液，培养至186h后结束发酵，检测普伐他汀含量和美伐他汀含量分别为18116mg/l和21mg/l，共加入美伐他汀73.5g，转化率达74％。本实施例中发酵培养基中的增殖培养时间为40小时，马杜拉放线菌转化美伐他汀为普伐他汀的时间为146小时(186-40＝146小时)。
实施例2用马杜拉放线菌转化美伐他汀生产普伐他汀的发酵方法
本实施例采用50l全自动发酵罐，用马杜拉放线菌转化美伐他汀生产普伐他汀，具体步骤如下所示：本实施例的麸皮浸汁是按如下方法制备的：取麸皮，加入其重量10倍量的水，浸泡4h，然后加热，回流提取1h，使用6层纱布过滤，得到麸皮浸汁。
种子培养方法同实施例1。
发酵培养操作如下所示：首先按照如下配方配制30l发酵培养基：葡萄糖58g/l，酵母提取物24g/l，大豆蛋白胨6g/l，k2hpo4·3h2o2g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，(nh4)2so42g/l，麸皮浸汁5.0ml/l，消沫剂1g/l。
发酵培养基灭菌后接入2.5l种子液，在32～34℃下培养30小时，调节发酵温度为30～32℃并在微生物转化美伐他汀过程保持此温度，补入美伐他汀溶液，以hplc法检测美伐他汀浓度使其维持在0.8～1.0g/l，培养至175小时后停止补加美伐他汀溶液，培养至189小时后结束发酵，检测普伐他汀含量和美伐他汀含量分别为18433mg/l和13mg/l，共加入美伐他汀797.1g，转化率达75％。
本实施例中发酵培养基中的增殖培养时间为30小时，马杜拉放线菌转化美伐他汀为普伐他汀的时间为159小时。
实施例3对照例
本实施例采用50l全自动发酵罐，用马杜拉放线菌转化美伐他汀生产普伐他汀。本实施例发酵培养基中不添加麸皮浸汁，其余各项参数与实施例2一致。实施步骤如下：
种子培养方法同实施例1。
发酵培养操作如下所示：首先按照如下配方配制30l发酵培养基：葡萄糖58g/l，酵母提取物24g/l，大豆蛋白胨6g/l，k2hpo4·3h2o2g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，(nh4)2so42g/l，消沫剂1.0g/l。
发酵培养基灭菌后接入2.5l种子液，控制增殖培养温度为32～34℃，培养30小时，转化培养温度为30～32℃，发酵培养至189小时结束，检测普伐他汀含量和美伐他汀含量分别为15016mg/l和24mg/l，共加入美伐他汀762.5g，转化率64％。
实施例3中，发酵培养基未加入麸皮浸汁，为现有技术。结果发现，与现有技术(实施例3)相比，本发明实施例2的发酵方法中，由于发酵培养基中加入了麸皮浸汁，发酵普伐他汀水平相对于实施例3提高约23％，美伐他汀转化率提高11％。
由此说明，发酵培养基中加入麸皮浸汁可有效地提高普伐他汀发酵水平和美伐他汀的转化率。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。