本发明涉及制取降血脂肽方法
技术领域：
，尤其涉及一种用水蛭制取降血脂肽的方法。
背景技术：
：本部分中的陈述仅仅提供了与本发明公开的内容有关的背景信息，且可能不构成现有技术。食源性蛋白经酶解得到的水解产物大部分是几个氨基酸残基组成的短肽，这些短肽以完整的形式被吸收进入循环系统而被组织利用，具有许多生理活性：抗氧化，提高免疫力，抗菌消炎,降血脂,促进微量元素的被动转运过程及在体内储存、抗高血压活性等。HMG-Co还原酶是体内催化3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)生成二羟甲基戊酸(MVA)的关键酶，这一步是体内合成胆固醇的限速步骤，也是目前最主要的高血脂症临床药物的靶点。HMG-CoA还原酶抑制剂是降血脂功效成分和药物筛选主要手段之一。从蛋白质经酶解产生的降血脂肽具有食用安全性高、无副作用、疗效好的优点，近年来受到广泛关注。目前人们已经成功的从大豆、大米、土豆、荞麦、鳕鱼、大西洋鲑、鲢鱼、蚕蛹、乳清蛋白中获得了HMG-CoA还原酶抑制肽。但上述研究分离方法成本高，规模化生产的成本也较高，并且原料多为人们的生活食物。九十年代后期，国内外关于蛋白酶解肽的研究主要围绕在蛋白质的水解度、分子量大小、游离氨基酸含量、生物酶重复利用以及对苦味的控制和去除等。目前，市场上使用的降脂药物大都为化学合成的他汀类药物，虽然其对改善由高血脂引起的心脑血管疾病有很好的疗效，但长期使用会有带来一系列的不良反应和副作用。水蛭作为一味传统中药，历史悠久，中医认为水蛭有破血、逐淤、通经等功效。自从二十世纪五十年代从医用水蛭中分离出具有抗凝作用的物质一水蛭素后，国内外已对其进行了广泛而深入的药理学研究。但现有技术尚未涉及从水蛭中提取降血脂肽的方法。传統中药的服用也是用水煮分解并提取(干品)水蛭中的多肽物质，只是用水煮方式得到的水蛭多肽物质非常有限。故现有技术有待改进和发展。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是提供一种分离方法成本低的用水蛭制取降血脂肽的方法。本发明的技术解决方案是：一种用水蛭制取降血脂肽的方法，包括将天然水蛭净化、磨浆、酶解、灭酶、离心分离、超滤和冷冻干燥，最终得到的水蛭制取降血脂肽。S1：水蛭的耐饥饿能力较强，一次吸饱血后能够多天甚至数月不进食，而食物残留会影响到最终的酶解产物。动物在缺氧条件下会发生呕吐，这样可除去水蛭体内未消化的食物。将洗净的水蛭放入压力为90-95kPa的减压容器中放置3-5h后，清洗沥干；S2：在S1得到的水蛭中加入上述水蛭重量3-5倍,浓度在3mg/L～6mg/L臭氧水中维持5min～10min，以杀灭水蛭表面微生物再调节pH值为6.8～7.2。S3：S2后在匀浆机中搅拌3-6min后，静置3-5h，得匀浆液；S4：升温至85℃～95℃并保温8min～12min后自然冷却至45℃～50℃；再加入中性蛋白酶进行酶解反应，将酶解反应所得产物升温至95℃～105℃并保持此温度10min～15min，再自然冷却至室温以终止酶解反应；离心，得酶解液；S5：将步骤S4得到的酶解液加入转速为9000-10000rpm的离心机中离心8-12min，留上清液，再采用超滤膜进行超滤处理，截留分子量8k的超滤膜，得超滤酶解液；在温度为-60℃～-70℃，真空度为15-20pa条件下冷冻2-4h，然后在温度为40-50℃干燥10-12h，即得水蛭降血脂肽。天然水蛭净化步骤是在缺氧条件下进行的。S4中的酶解反应中每克蛋白质加入2000～4000u且酶解3-6小时。S5中采用超滤膜进行超滤处理其工作条件是0.1～0.2Mpa的工作压力和0～45℃的工作温度。本发明的有益效果：用水蛭制取降血脂肽的方法，包括将天然水蛭净化、磨浆、酶解、灭酶、离心分离、超滤和冷冻干燥，最终得到的水蛭制取降血脂肽，该方法分离方法成本低，规模化生产的成本也较低，并且水蛭作为传统中药具有破血、逐淤、通经等功效。具体实施方式实施例：一种用水蛭制取降血脂肽的方法，包括将天然水蛭净化、磨浆、酶解、灭酶、离心分离、超滤和冷冻干燥，最终得到的水蛭制取降血脂肽。具体步骤如下：S1：将洗净的水蛭放入压力为90-95kPa的减压容器中放置3-5h后，清洗沥干；S2：在S1得到的水蛭中加入上述水蛭重量3-5倍,浓度在3mg/L～6mg/L臭氧水中维持5min～10min，以杀灭水蛭表面微生物。S3：S2后在均质机中搅拌3-6min后，再调节pH值为6.8～7.2，静置3-5h，得匀浆液；S4：升温至85～95℃并保温8～12min后自然冷却至45℃～50℃；再加入中性蛋白酶进行酶解反应，将酶解反应所得产物升温至95～105℃并保持此温度10～15min，再自然冷却至室温以终止酶解反应；在步骤S1中减压与未减压的对照数据如下表:未减压处理前(沥干)减压处理清洗后(沥干)27.4kg26.1kg酶解液实验对照数据:如下S5：将步骤S4得到的酶解液加入转速为9000-10000rpm的离心机中离心8-12min，留上清液，再采用超滤膜进行超滤处理，截留分子量8k的超滤膜，得超滤酶解液；在温度为-60℃～-70℃，真空度为15-20Mpa条件下冷冻2-4h，然后在温度为40-50℃干燥10-12h，即得水蛭降血脂肽。按照已经公开发表的专利号为201110073398.8的《一种检测HMG-CoA还原酶活性的改良分光光度法》进行检测，测得其IC50为0.96mg/ml。作为优选，天然水蛭净化步骤是在缺氧条件下进行的。进一步，S4中的酶解反应中每克蛋白质加入2000～4000u且酶解3-6小时。更为进一步的是，S5中采用超滤膜进行超滤处理其工作条件是0.1～0.2Mpa的工作压力和0～45℃的工作温度。用水蛭制取降血脂肽样品于GEL-HPLC中进样以后，用液相数据处理软件将水蛭降血脂肽的凝胶色谱数据代入校正曲线方程中进行计算，得到样品的肽的相对分子质量及其分布范围。分子量1000Da以下组分中的二肽、三肽的在人体内的吸收利用率极高，具有比游离氨基酸更高的营养价值，但不分子量却有不同生理功能。用同样方法测得天然水蛭素是由65～66氨基酸组成的低分子多肽，其分子量仅为7000道尔顿。天然水蛭素是迄今为止世界上所发现的最强的天然抗凝血酶物质，对人类心脑血管疾病尤其是脑血栓等血栓性疾病有特效，其防治效果是任何物质所不能比拟的。本发明以功能肽的分子量7000Da作为分子量范围界值，用峰面积归一化法计算了用水蛭制取降血脂肽的相对分子质量分布范围，由分子量分布结果可以看出，分子量小于7000Da的组分总共占93.05％。将按照已经公开发表的专利号为201110073398.8的《一种检测HMG-CoA还原酶活性的改良分光光度法》进行检测，测得其IC50为0.63mg/ml。用管式离心机将酶解液离心，转速14000r/min，分离出清液和渣料，留用离心清液。将上述清液用孔径0.06μm的微滤和超滤设备进行过滤，条件为压力0.3MPa，温度55℃，制得澄清的用水蛭制取降血脂肽透过液。酶解液加入转速为9000-10000rpm的离心机中离心8-12min，留上清液，再采用超滤膜进行超滤处理，截留分子量8k的超滤膜，得超滤酶解液；在温度为-60℃～-70℃，真空度为15-20Mpa条件下冷冻2-4h，然后在温度为40-50℃干燥10-12h，即得水蛭降血脂肽。将本发明所制得水蛭降血脂肽用《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)进行动物实验，并与孔径不同截留分子量的膜过滤物进对照实验，其结果如下：由此可判断，唯有本发明分子量段的样品有降血脂功能在本说明书的描述中，术语“一个实施例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或实例。而且，描述的具体特征、结构、材料或特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页1 2 3