本发明属于生物提取技术领域，具体涉及一种青蛤免疫增强肽的制备方法及应用。
背景技术：
免疫是机体对病原微生物侵袭的防卫功能及维持内环境的稳定—清除衰老、死亡、受伤细胞和监视、清除突变细胞的功能，当机体免疫功能低下或障碍时，将会发生重症感染、肿瘤和肌体早衰等。随着人们对疾病治疗观念的转变，治疗的重点已经由直接杀伤外源性病原体转向调整生物机体自身功能，从而免疫增强剂在医学的应用引起了广泛的关注，免疫增强剂的研究已经成为医学最活跃的研究领域之一，寻找天然的免疫调节剂，增强机体免疫是当今肿瘤治疗的重要而有效的途径。
青蛤是我国沿海常见的贝类，属于优质蛋白原。青蛤提取物具有抗氧化性、抗肿瘤和提高免疫力的功能。
现有技术提供多种生物制备免疫增强肽的方法，例如，中国发明授权专利文献 一种免疫增强贻贝酶解多肽的制备方法及其相应片剂的制备方法 授权公告号CN 102952838 B一种免疫增强贻贝酶解多肽及其相应片剂的制备方法，步骤为：以贻贝干粉作为原料，与缓冲液按照1 ∶ 20 ～ 1 ∶ 25 的重量体积比混合、匀浆，然后调节pH 值至9.5 ～ 10，得混合液；将混合液温度升至50 ～ 55℃预热10 ～ 15 分钟，按照原料的1.0％～ 1.5％分别加入碱性蛋白酶和中性蛋白酶，酶解温度为50 ～ 55℃，酶解时间2 ～ 4h ；将所得的酶解产物先经灭酶处理，得酶解液，所述酶解液依次经脱盐、浓缩和喷雾干燥，得免疫增强酶解多肽；该发明还公开了相关的免疫增强型贻贝多肽片。该发明的制备方法简单，得到的免疫增强肽及其片剂具有较高的活性，同时原料资源丰富，具有较强的工业实施性。
现有技术的制备方法简单，得到的免疫增强肽活性较高，但仅通过碱性蛋白酶和中性蛋白酶进行酶解，酶解效果一般，在提取免疫增强肽的提取率上有待提高。
技术实现要素：
本发明针对上述技术问题提供一种采用超声波辅助预处理，酶解效果优异，具有活性的免疫增强肽提取率高的一种青蛤免疫增强肽的制备方法及应用。
本发明为解决上述技术问题所采取的的方案为：一种青蛤免疫增强肽的制备方法，制备步骤如下：
1）预处理：将青蛤去壳取肉放入去离子水中浸泡，匀浆，超声波处理，低温存放；通过浸泡将青蛤肉中杂质溶解及杀灭细菌，对青蛤肉无损害，不影响提取免疫增强肽的活性，用匀浆机进行匀浆后采用超声波处理可将青蛤肉组织进一步细化处理，提升后续酶解的效果，低温存放超声波处理后浆液。
2）酶解：加入氢氧化钠溶液调节pH值，加入青蛤肉2~10%重量份的复合酶进行酶解，灭酶，离心，取上清液；加入氢氧化钠溶液快速调节pH值到指定范围，达到酶解所需的pH值，加入复合酶进行酶解，整个酶解过程可控，酶解液中的免疫增强肽含量明显提高，并且防止免疫增强肽失去活性，提升获得的免疫增强肽功效。再经灭酶，离心得上清液。
3）膜分离：在上清液中加入青蛤肉1~2%重量份的析出剂，进行膜分离处理，减压浓缩；加入析出剂把存在未酶解充分的蛋白质析出免疫增强肽，以提高上清液中免疫增强肽的含量，提高青蛤免疫增强肽的提取率，经膜分离处理获得分子量为3000~10000Da的青蛤免疫增强肽液，此范围的青蛤免疫增强肽密集度高，具有较高的活性，抗肿瘤功能和增强免疫力效果优异，利于人体吸收。
4）冻干：将浓缩液冻干保存，采用真空冷冻干燥机将浓缩液冻干保存，得青蛤免疫增强肽。可有效的长期保存青蛤免疫增强肽，且青蛤免疫增强肽不变质，保证活性，损失量少。
析出剂由以下成分及重量份组成：硫酸铵3~5份、氯化钠1~3份、硝酸钾0.5~1份、磷酸二氢钾0.2~0.7份和白藜芦醇0.1~0.3份。采用的复合酶可酶解青蛤肉中的蛋白质，酶解效果优异，酶解过程中可能存在未被酶解的蛋白质，为防止这种情况，加入析出剂来达到蛋白质被充分的析出青蛤免疫增强肽的效果，以此提升上清液中免疫增强肽的含量和密集度，使青蛤免疫增强肽的提取率得到提高。
步骤1中去离子水体积是青蛤肉的3~5倍，采用超声波仪处理青蛤肉浆，超声功率为90~290W，超声时间为10~30min，在2~6℃条件下存放10~50min。匀浆机进行匀浆后采用超声波处理可将青蛤肉组织进一步细化处理，提升后续酶解的效果。
步骤1中去离子水添加有：枸橼酸钠3~7重量份、氯化钠5~9重量份、硫酸镁8~12重量份、对氨基苯甲酸2~4重量份、4-氨基安替比林1~5重量份、磷酸氢二钠3~7重量份、磷酸二氢钾1~5重量份、羧甲基纤维素钠1~2重量份和一乙胺0.3~0.7重量份。
步骤2中加入3.0~10.0mol/L的氢氧化钠溶液在35~45℃条件下调节pH值至6~8。达到快速调节pH值的效果，节省时间，提高制备效率。
步骤2中氢氧化钠溶液添加有酞酸丁基苄酯0.7~0.9重量份，配合氢氧化钠调节pH值，提升pH值调节速度，节约时间，对酶解过程无影响，不损伤青蛤蛋白质。
步骤2中加入青蛤肉2~10%重量份的复合酶在30~50℃条件下酶解1~3h。控制酶解过程，使复合酶对青蛤蛋白质充分酶解，提升得到的酶解液中青蛤免疫增强肽含量和密集度。
步骤2中将酶解液沸水浴灭酶，在90~95℃条件下保温10~30min。避免复合酶持续酶解及对后续的添加析出剂及获得的免疫增强肽的活性，提取率影响。
复合酶由以下成分及重量份组成：木瓜蛋白酶10~15份、中性蛋白酶6~12份、碱性蛋白酶2~4份、三磷酸腺苷酶1~3份、阿替普酶2~3份、核酸内切酶0.7~1.5份。
步骤2中采用离心机进行离心，离心转速8000~10000r/min，离心时间10~20min，去除不可溶杂质。
步骤3中膜分离处理的膜分截流量为3000~10000Da，获得分子量3000~10000Da的青蛤免疫增强肽液，在此范围的青蛤免疫增强肽密集度高，具有较高的活性，抗肿瘤功能和增强免疫力效果优异，利于人体吸收。
从青蛤中提取到的免疫增强肽在抗肿瘤药物和免疫增强药物中应用。
有益效果：本发明通过浸泡将青蛤肉中杂质溶解及杀灭细菌，对青蛤肉无损害，不影响提取免疫增强肽的活性，用匀浆机进行匀浆后采用超声波处理可将青蛤肉组织进一步细化处理，提升后续酶解的效果。加入氢氧化钠溶液快速调节pH值到指定范围，节省时间，加入复合酶进行酶解，整个酶解过程可控，酶解液中的免疫增强肽含量明显提高，并且防止免疫增强肽失去活性，提升获得的免疫增强肽功效。加入析出剂把存在未酶解充分的蛋白质析出免疫增强肽，以提高上清液中免疫增强肽的含量，提高青蛤免疫增强肽的提取率。本发明提取的青蛤免疫增强肽密集度和提取率高，具有较高的活性，抗肿瘤功能和增强免疫力效果优异，利于人体吸收。
具体实施例
以下结合具体实施例作进一步详细描述：
实施例1：
一种青蛤免疫增强肽的制备方法，制备步骤如下：
1）预处理：将青蛤去壳取肉放入去离子水中浸泡10~12h，匀浆，超声波处理，低温存放；通过浸泡将青蛤肉中杂质溶解及杀灭细菌，对青蛤肉无损害，不影响提取免疫增强肽的活性，用匀浆机进行匀浆后采用超声波处理可将青蛤肉组织进一步细化处理，提升后续酶解的效果，低温存放稳定超声波处理后浆液的活性。
2）酶解：加入氢氧化钠溶液调节pH值，加入青蛤肉2~10%重量份的复合酶进行酶解，灭酶，离心，取上清液；加入氢氧化钠溶液快速调节pH值到指定范围，达到酶解所需的pH值，加入复合酶进行酶解，整个酶解过程可控，酶解液中的免疫增强肽含量明显提高，并且防止免疫增强肽失去活性，提升获得的免疫增强肽功效。再经灭酶，离心得上清液。
3）膜分离：在上清液中加入青蛤肉1~2%重量份的析出剂，进行膜分离处理，减压浓缩；加入析出剂把存在未酶解充分的蛋白质析出免疫增强肽，以提高上清液中免疫增强肽的含量，提高青蛤免疫增强肽的提取率，经膜分离处理获得分子量为3000~10000Da的青蛤免疫增强肽液，此范围的青蛤免疫增强肽密集度高，具有较高的活性，抗肿瘤功能和增强免疫力效果优异，利于人体吸收。
4）冻干：将浓缩液冻干保存，采用真空冷冻干燥机将浓缩液冻干保存，得青蛤免疫增强肽。可有效的长期保存青蛤免疫增强肽，且青蛤免疫增强肽不变质，保证活性，损失量少。
析出剂由以下成分及重量份组成：硫酸铵3~5份、氯化钠1~3份、硝酸钾0.5~1份、磷酸二氢钾0.2~0.7份和白藜芦醇0.1~0.3份。采用的复合酶可酶解青蛤肉中的蛋白质，酶解效果优异，酶解过程中可能存在未被酶解的蛋白质，为防止这种情况，加入析出剂来达到蛋白质被充分的析出青蛤免疫增强肽的效果，以此提升上清液中免疫增强肽的含量和密集度，使青蛤免疫增强肽的提取率得到很大的提高。
步骤1中去离子水体积是青蛤肉的3~5倍，采用超声波仪处理青蛤肉浆，超声功率为90~290W，超声时间为10~30min，在2~6℃条件下存放10~50min。匀浆机进行匀浆后采用超声波处理可将青蛤肉组织进一步细化处理，提升后续酶解的效果。
步骤1中去离子水添加有：枸橼酸钠3~7重量份、氯化钠5~9重量份、硫酸镁8~12重量份、对氨基苯甲酸2~4重量份、4-氨基安替比林1~5重量份、磷酸氢二钠3~7重量份、磷酸二氢钾1~5重量份、羧甲基纤维素钠1~2重量份和一乙胺0.3~0.7重量份。
步骤2中加入3.0~10.0mol/L的氢氧化钠溶液在35~45℃条件下调节pH值至6~8。达到快速调节pH值的效果，节省时间，提高制备效率。
步骤2中氢氧化钠溶液添加有酞酸丁基苄酯0.7~0.9重量份，配合氢氧化钠调节pH值，提升pH值调节速度，节约时间，对酶解过程无影响，不损伤青蛤蛋白质。
步骤2中加入青蛤肉2~10%重量份的复合酶在30~50℃条件下酶解1~3h。控制酶解过程，使复合酶对青蛤蛋白质充分酶解，提升得到的酶解液中青蛤免疫增强肽含量和密集度。
步骤2中将酶解液沸水浴灭酶，在90~95℃条件下保温10~30min。避免复合酶持续酶解及对后续的添加析出剂及获得的免疫增强肽的活性，提取率影响。
复合酶由以下成分及重量份组成：木瓜蛋白酶10~15份、中性蛋白酶6~12份、碱性蛋白酶2~4份、三磷酸腺苷酶1~3份、阿替普酶2~3份、核酸内切酶0.7~1.5份。
步骤2中采用离心机进行离心，离心转速8000~10000r/min，离心时间10~20min，去除不可溶杂质。
步骤3中膜分离处理的膜分截流量为3000~10000Da，获得分子量3000~10000Da的青蛤免疫增强肽液，在此范围的青蛤免疫增强肽密集度高，具有较高的活性，抗肿瘤功能和增强免疫力效果优异，利于人体吸收。
从青蛤中提取到的免疫增强肽在抗肿瘤药物和免疫增强药物中应用。
实施例2：
一种青蛤免疫增强肽的制备方法，优选制备步骤如下：
1）预处理：将青蛤去壳取肉放入去离子水中优选浸泡10h后，去离子水体积是青蛤肉优选的的5倍，用匀浆机进行匀浆再用超声波仪处理青蛤肉浆，超声功率优选为270W，超声时间优选为15min，优选在4℃条件下存放30min。通过浸泡将青蛤肉中杂质溶解及杀灭细菌，对青蛤肉无损害，不影响提取免疫增强肽的活性，用匀浆机进行匀浆后采用超声波处理可将青蛤肉组织进一步细化处理，提升后续酶解的效果，低温存放稳定超声波处理后浆液的活性。
2）酶解：加入优选的8mol/L的氢氧化钠溶液在优选40℃条件下优选调节pH值至8，加入优选的青蛤肉7%重量份的复合酶在优选45℃条件下优选酶解2h，将酶解液沸水浴灭酶，在优选的92℃条件下优选保温20min，避免复合酶持续酶解，采用离心机进行离心，优选离心转速9000r/min，优选离心时间15min，去除不可溶杂质，取上清液；加入氢氧化钠溶液快速调节pH值到指定值，达到酶解所需的pH值，加入复合酶进行酶解，整个酶解过程可控，酶解液中的免疫增强肽含量明显提高，并且防止免疫增强肽失去活性，提升获得的免疫增强肽功效。
3）膜分离：在上清液中加入优选的青蛤肉1.2%重量份的析出剂，进行膜分离处理，膜分离处理的膜分截流量为优选的3000Da，获得青蛤免疫增强肽液，减压浓缩；加入析出剂把存在未酶解充分的蛋白质析出免疫增强肽，以提高上清液中免疫增强肽的含量，提高青蛤免疫增强肽的提取率，经膜分离处理获得青蛤免疫增强肽液，密集度高，具有较高的活性，抗肿瘤功能和增强免疫力效果优异，利于人体吸收。
4）冻干：将浓缩液冻干保存，采用真空冷冻干燥机将浓缩液冻干保存，得青蛤免疫增强肽。可有效的长期保存青蛤免疫增强肽，且青蛤免疫增强肽不变质，保证活性，损失量少。
析出剂由以下成分及重量份组成：优选硫酸铵4份、优选氯化钠2份、优选硝酸钾0.7份、优选磷酸二氢钾0.5份和优选白藜芦醇0.2份。采用的复合酶可酶解青蛤肉中的蛋白质，酶解效果优异，酶解过程中可能存在未被酶解的蛋白质，为防止这种情况，加入析出剂来达到蛋白质被充分的析出青蛤免疫增强肽的效果，以此提升上清液中免疫增强肽的含量和密集度，使青蛤免疫增强肽的提取率得到提高。
去离子水添加有：优选枸橼酸钠5重量份、优选氯化钠6重量份、优选硫酸镁10重量份、优选对氨基苯甲酸3重量份、优选4-氨基安替比林3重量份、优选磷酸氢二钠4重量份、优选磷酸二氢钾2重量份、优选羧甲基纤维素钠1.5重量份和优选一乙胺0.4重量份。
氢氧化钠溶液添加有优选的酞酸丁基苄酯0.75重量份，配合氢氧化钠调节pH值，提升pH值调节速度，节约时间，对酶解过程无影响，具有活性的免疫增强肽提取率高，不损伤青蛤蛋白质。
复合酶由以下成分及重量份组成：优选木瓜蛋白酶13份、优选中性蛋白酶8份、优选碱性蛋白酶3份、优选三磷酸腺苷酶2份、优选阿替普酶2份、优选核酸内切酶1.2份。
从青蛤中提取到的免疫增强肽在抗肿瘤药物和免疫增强药物中应用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。