本发明涉及水产食品加工技术领域，具体地涉及一种具有抗氧化活性的蛋白肽及其制备方法。
背景技术：
蛋白质经过酶解得到多肽，使其蛋白质的结构发生改变，疏水区的活性官能基团暴露，随着肽键的裂解，小分子蛋白肽和氨基酸增加，从而可以提供质子或电子源，保持较高的氧化还原电位，使其具有清除活性自由基的能力。氧化对需氧生物特别是脊椎动物和人类是一个重要的代谢过程，但是它却导致了自由基的形成。活性氧自由基(ROS)被认为能引起氧化应激。在食品体系中，脂类或蛋白质可能会受到ROS的攻击经历氧化过程，从而导致食品产生不愉快味道，颜色发暗，同时也可能产生潜在的毒性终产物。抗氧化多肽的应用能防止食品成分由于捐献电子给活性氧自由基以及中和活性氧自由基的负面作用而变质。抗氧化肽在医学、化妆品、生物、食品领域有广泛的应用价值。
化学合成抗氧化肽不同程度上损伤人体的肝脏、肾脏等器官，部分国家和地区已经明确限量或禁止使用。因此，研发高效、安全的天然抗氧化剂成为热点。食用级抗氧化肽的安全性要求更高，抗氧化性较其他体内抗氧化生物分子更为显著，可以稳定脂质或含脂质产品。天然的抗氧化多肽因分子量小、易吸收、活性强等特点。目前天然抗氧化肽主要是通过酶解大豆蛋白、奶酪、乳清蛋白、动物胶、面筋等各种食物蛋白获得。最近几年发展到海洋产品如海藻、虾皮、两栖动物裸露皮肤分泌物、真菌等。
有关天然抗氧化活性肽的制备方法，现有技术的不足在于大多数蛋白肽酶解过程中通过添加酸或碱调节pH，明显地影响产品的风味，同时产品的灰分较高。
目前还没有以鱼肉为原料制备抗氧化肽的报道。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明的目的是在于提供一种具有抗氧化活性的蛋白肽。
本发明的另一目的在于提供上述蛋白肽的制备方法。
本发明的再一个目的在于提供上述蛋白肽的应用。
为了实现上述技术目的，本发明提供了一种具有抗氧化活性的蛋白肽及其制备方法，包括以下步骤:
(1)超声处理去脂的鱼肉浆液；
(2)加入复合蛋白酶进行酶解，酶解过程无需添加酸或碱调节pH值；
(3)对酶解液离心并取上清液进行超滤；
(4)滤液过柱层析分离，收集洗脱峰，洗脱液通过反向高效液相色谱进行分离即得。
可选的，所述鱼肉为淡水鱼肉或海水鱼肉。在本发明的实施例中选用鳙鱼和鳕鱼。
在本发明的一个实施例中，步骤(1)所述去脂的鱼肉浆液通过以下方法制备得到：洗净鱼肉，用打浆机将鱼肉打成浆，得鱼肉浆；然后向鱼肉浆中加入0.8-2.0倍鱼肉重量的水，在85-95℃下水浴10-15min，再用分散均质机在8000-10000rpm下匀浆1-3min，得鱼肉浆液；通过6000-8000g离心10-15min，去上层脂肪，得到去脂的鱼肉浆液。本领域技术人员应当理解，去脂的鱼肉浆液的制备方法包括但不限于上述方法。
步骤(1)超声处理方法为将去脂的鱼肉浆液温度调至50-65℃，30-45kH的超声频率处理15-25min。
本发明通过大量实验发现，鱼肉浆液温度调至50-65℃进行超声处理，效果最好，能够较好地改变鱼肉蛋白的组织结构，使下面酶解步骤在较短酶解时间和较小的用酶量就能够获得优质的蛋白肽。
步骤(2)酶解加入的复合蛋白酶为碱性蛋白酶、风味蛋白酶和菠萝蛋白酶，三者质量比为(2-3):(1-2):(1-2)，且加入的复合蛋白酶总质量与鱼肉质量比为1：300-500。
优选地，所述碱性蛋白酶为Alcalase 2.4L碱性蛋白酶。
步骤(2)中酶解条件为55-65℃酶解2-5h。
步骤(2)酶解后将酶解液在95-100℃下保温3-5min，冷却至室温。
步骤(3)离心条件为5000-7000g 10-15min；采用2000D的超滤膜进行超滤。
在本发明的一个实施例中，是利用孔径为2000道尔顿的陶瓷膜对步骤(2)所得的上清液进行超滤，收集滤液，再经过Sephadex G-25凝胶分离，洗脱液为去离子水，流速为0.8mL/min，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第1个洗脱峰；再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行1次分离，反相HPLC的分离条件是以5-90％乙腈溶液(0-5min乙腈溶液为5％，5-40min乙腈溶液从5％到40％，40-50min乙腈溶液从40％到90％)作为洗脱液，流速为5-8mL/min，得到含抗氧化活性肽的溶液。
制备方法制备得到的蛋白肽属于本发明的保护范围。在制得的蛋白肽中，氨基酸序列为Lys-Ala-Gln–Arg-Leu-Lys-Glu(SEQ ID NO.1)和Lys-Gln-Ser-Asp-Val(SEQ ID NO.2)的肽的含量大于40％。
通过进一步功能验证，发现上述肽具有优异的抗氧化活性。进而本发明提供一种具有抗氧化活性的蛋白肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
本发明上述方法制得的蛋白肽或氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示肽的抗氧化用途属于本发明的保护范围。
含有本发明上述方法制得的蛋白肽或氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示肽的食品、保健品、化妆品或药物属于本发明的保护范围。
本发明的优点在于：
(1)本发明开发的生产工艺中没有添加酸或碱进行pH的调整，产品保持较好的功能特性，较易实现产业化生产。
(2)本发明鱼肉抗氧化活性肽中Lys-Ala-Gln–Arg-Leu-Lys-Glu和Lys-Gln-Ser-Asp-Val的肽的含量40％以上。具有很好的抗氧化功能，其清除DPPH自由基能力可达92％以上。
(3)本发明鱼肉抗氧化活性肽是以天然产物为原料、经过食品级复合蛋白酶酶解获得的产物，将其作为食品、化妆品的配料，安全，无毒。
(4)本发明鱼肉抗氧化活性肽制备方法简单，易实现产业化生产，有效地解决了目前抗氧化多肽难以实现产业化生产的问题。
(5)本发明开发的抗氧化肽具有较好的风味和热稳定性，能广泛应用于功能食品。
具体实施方式
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除有特别说明，本发明中用到的各种试剂、原料均为可以从市场上购买的商品或者可以通过公知的方法制得的产品。
实施例1鳙鱼鱼肉抗氧化活性肽的制备
(1)将鳙鱼鱼肉100克洗净，用打浆机将鱼肉打成浆,得鱼肉浆；然后向鱼肉浆中加入1.5倍鱼肉重量的水150克，在95℃中水浴20min，再用分散均质机在10000rpm下匀浆2min，得到鱼肉浆液250克。通过6000g离心10～min，去上层脂肪，得到去脂的鱼肉浆液230克。将去脂鱼肉浆液的温度调整到55℃，于超声波发生器中经超声波(频率为35kH)处理15分钟。
(2)调节步骤(1)鱼肉浆液的温度为55℃，然后按照复合蛋白酶与鱼肉质量比为1：300的比例加入复合蛋白酶(碱性蛋白酶：风味蛋白酶:菠萝蛋白酶＝2:1：1)0.33克，在55℃下酶解2小时，然后在95℃下保温3min，冷却至室温，再在5000g条件下离心15min，收集上清液；
(3)利用孔径为2000道尔顿的陶瓷膜对步骤(2)所得的上清液进行超滤，收集滤液，再经过Sephadex G-25(长60cm，直径4.6cm)凝胶色谱分离，洗脱液为去离子水，流速为0.8mL/min，洗脱峰在280nm下进行测量，收集第1个洗脱峰，再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行1次分离，反相HPLC的分离条件是以5～90％乙腈溶液作为洗脱液，流速为1mL/min，得到高活性的抗氧化肽溶液；
(4)将步骤(3)得到的抗氧化活性肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到鱼肉抗氧化活性肽。
通过LC-MS/MS对所得的鱼肉抗氧化活性肽的主要成分进行测定，其氨基酸序列为Lys-Ala-Gln–Arg-Leu-Lys-Glu和Lys-Gln-Ser-Asp-Val的肽的含量为40.3％。
实施例2鳙鱼鱼肉抗氧化活性肽的制备
(1)将鳙鱼鱼肉500克洗净，用打浆机将鱼肉打成浆，得鱼肉浆；然后向鱼肉浆中加入2.0倍鱼肉重量的水1000克，在90℃中水浴20min，再用分散均质机在12000rpm下匀浆2min，得到鱼肉浆液1500克。通过8000g离心10min，去上层脂肪，得到去脂的鱼肉浆液1430克。将去脂鱼肉浆液的温度调整到60℃，于超声波发生器中经超声波(频率为45kH)处理20分钟。
(2)调节(1)鱼肉浆液的温度为60℃，然后按照复合蛋白酶(碱性蛋白酶：风味蛋白酶:菠萝蛋白酶＝2:2：1)与鱼肉质量比为1：400加入复合蛋白酶1.25克，在65℃下酶解3小时，然后在95℃下保温4min，冷却至室温，再在5000g条件下离心15min，收集上清液；
(3)利用孔径为2000道尔顿的陶瓷膜对步骤(2)所得的上清液进行超滤，收集滤液，再经过Sephadex G-25(长60cm，直径4.6cm)凝胶色谱分离，洗脱液为去离子水，流速为0.8mL/min，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第1个洗脱峰，再用RP-HPLC反相高校液相色谱进行1次分离，反相HPLC的分离条件是为5～90％乙腈溶液作为洗脱液，流速为1mL/min，得到高活性的抗氧化肽溶液；
(4)将步骤(3)得到的抗氧化活性肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得鱼肉抗氧化活性肽。
通过LC-MS/MS对所得的鱼肉抗氧化活性肽的主要成分进行测定，其氨基酸序列为Lys-Ala-Gln–Arg-Leu-Lys-Glu和Lys-Gln-Ser-Asp-Val的肽的含量为41.6％。
实施例3鳕鱼肉抗氧化活性肽的制备
(1)将鳕鱼鱼肉1000克洗净，用打浆机将鱼肉打成浆，得鱼肉浆；然后向鱼肉浆中加入2.0倍鱼肉重量的水2000克，在90℃中水浴15min，用分散均质机在12000rpm匀浆2min，得到鱼肉浆液3000克。通过6000g离心15min，去上层脂肪，得到去脂的鱼肉浆液2880克。将去脂鱼肉浆液的温度调整到60℃，于超声波发生器中经超声波(频率为40kH)处理15分钟。
(2)调节步骤(1)鱼肉浆液的温度为65℃，然后按照复合蛋白酶(碱性蛋白酶：风味蛋白酶:菠萝蛋白酶＝3:1：1)与鱼肉质量比为1：400加入2.5克，在65℃下酶解4小时，然后在95℃下保温5min，冷却至室温，再在5000g条件下离心15min，收集上清液；
(3)利用孔径为2000道尔顿的陶瓷膜对步骤(2)所得的上清液进行超滤，收集滤液，再经过Sephadex G-25((长60cm，直径4.6cm)凝胶色谱分离，洗脱液为去离子水，流速为0.8mL/min，洗脱峰在280nm下进行测量，收集第1个洗脱峰，再用RP-HPLC反相高校液相色谱进行1次分离，反相HPLC的分离条件是为5～90％乙腈溶液作为洗脱液，流速为1mL/min，得到高活性的抗氧化肽溶液；
(4)将步骤(3)得到的抗氧化活性肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到鱼肉抗氧化活性肽，
通过LC-MS/MS对所得的鱼肉抗氧化活性肽的主要成分进行测定，其氨基酸序列为Lys-Ala-Gln–Arg-Leu-Lys-Glu和Lys-Gln-Ser-Asp-Val的肽的含量为40.9％。
实施例4本发明鱼肉抗氧化活性肽的抗氧化活性的测定试验
试验样品：实施例1、实施例2、实施例3制备的鱼肉抗氧化活性肽。
按照如下方法进行：
(1)清除DPPH自由基能力：取1mg/mL的抗氧化活性肽1.5mL，加入99.5％乙醇1.5mL和0.02％DPPH乙醇溶液0.675mL混合，振荡混匀，室温下避光水浴30min，然后在517nm下检测体系吸光值。吸光值越低，体系的清除DPPH自由基能力越强。空白对照即是将样品溶液1.5mL换成去离子水1.5mL。
DPPH自由基清除能力％＝((空白吸光值-样品吸光值)/空白吸光值)×100
(2)还原力测定：取1mg/mL的抗氧化活性肽1mL，加入0.2M磷酸缓冲液(pH 6.6)2.5mL和1％(质量分数)的铁氰化钾溶液2.5mL，混匀，然后在50℃水浴加热20min。取出迅速冷却，加入10％(质量分数)三氯乙酸(TCA)溶液2.5mL，混合均匀，然后在3000g下离心10min。取上清液2.5mL，加入去离子水2.5mL和1％(质量分数)三氯化铁溶液0.5mL，充分混匀，在室温下反应10min，用700nm波长测定吸光度。还原力即可用700nm波长处吸光值表示。
(3)氧化自由基吸收能力(ORAC)：不同浓度的抗氧化活性肽溶液10μL与75mM磷酸盐缓冲液90μL(pH 7.4)及200nM的荧光试剂50μL充分混合，然后在37℃温育15min，再加入80mM的AAPH溶液50μL。用酶标仪每分钟读取荧光值共进行100min。荧光的激发波长和发射波长分别是485nm和538nm。用磷酸缓冲溶液代替样品作为空白。以Trolox作为标准对照，使用的浓度为0，2，4，8，12，16μM，绘制荧光淬灭曲线，并计算荧光淬灭曲线下的积分面积(AUC)。AUC的计算公式如下：
其中：f0是0min时荧光值，fi是第i min时的荧光值。
ORAC值用样品曲线的斜率与Trolox曲线的斜率之比，ORAC值得单位表示为μM Trolox/mg肽。
(4)清除ABTS自由基的测定
称取17mg过硫酸钾加26mL水得过硫酸钾溶液，取上述过硫酸钾溶液2.6mL，加入10mg ABTS，配制成ABTS母液，暗处放置12-16h后，取上述母液0.8mL，0.2M pH 7.4磷酸盐缓冲液稀释至在734nm下读数为0.70±0.02。取1.0mg/mL的样品溶液0.04mL与4mL稀释后的ABTS溶液混合震荡30s后避光放置6min在734nm下检测其吸光值，吸光值越小代表自由基清除能力越强。空白用蒸馏水代替样品。清除ABTS自由基能力计算公式如下：
ABTS自由基清除率％＝(1-A1-734/A2-734)×100
其中A1-734为样品在734nm下的读数，A2-734为对照品在734nm下的读数。
(5)Fe2+螯合能力的测定
取蛋白质浓度为1mg/mL的酶解产物待测液1.0mL与3.7mL浓度为99.5％的无水乙醇及0.1mL 2mM FeCl2混匀，加入5mM的啡咯嗪0.2mL启动反应，在室温下静置20分钟后在562nm出处检测吸光值，吸光值越小表示金属螯合能力越强。对照组中以0.1mL去离子水代替酶解产物溶液。亚铁离子螯合能力的计算公式如下：
Fe2+螯合率％＝(1-A1/A2)×100
其中A1为对照的吸光值，A2为样品的吸光值。
结果(见表1)本发明鱼肉抗氧化活性肽具有较好的抗氧化能力，在1mg/mL的条件下，其清除DPPH自由基能力达到92％以上，还原力达到0.88以上，其ORAC为18.5以上,ABTS自由基清除率85％以上，Fe2+螯合能力91％以上。是一种较理想的抗氧化肽。
表1本发明鱼肉抗氧化活性肽的分子量及抗氧化活性试验结果
以上的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案做出的各种变型和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。