技术领域：
本发明提供一种水痘-带状疱疹病毒糖蛋白e胞外区蛋白的制备方法，具体地说涉及含水痘-带状疱疹病毒糖蛋白e胞外区基因重组质粒载体，用该载体制备的转化体，及利用转化体制备水痘-带状疱疹病毒糖蛋白e胞外区蛋白，涉及该蛋白在单价、多价水痘或带状疱疹疫苗，及含有此成分的联合疫苗的研发、生产、检验检测领域的应用，属于生物工程技术领域。
背景技术：
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水痘-带状疱疹病毒（varicella-zostervirus，vzv）是引起水痘和带状疱疹的病原体，儿童时初发引起水痘，潜伏后可以再度激活引起带状疱疹。目前，控制水痘和带状疱疹的主要方法是接种疫苗。
水痘疫苗和带状疱疹疫苗现均为减毒活疫苗。减毒活疫苗的制备要求在经国家权威部门检测合格的细胞基质中进行，并且制备工艺复杂，工艺控制较为困难。另外，根据水痘减毒疫苗近20年的市场应用情况分析，接种水痘疫苗并不能完全保护接种者免受水痘侵袭，会有突破病例发生，以及疫苗株有潜伏的风险，这就是水痘-带状疱疹病毒病毒的特殊之处。带状疱疹减毒活疫苗应用于成人，对带状疱疹的发生有预防作用，根据减毒带状疱疹疫苗的临床应用分析，总体保护率为62%，效果差强人意。葛兰素史克公司用cho细胞表达vzv的ge糖蛋白，辅以as04佐剂制备的新一代带状疱疹疫苗，有效激发接种者的细胞免疫和体液免疫水平。根据其提供的iii期临床结果分析，有效率大于90%，效果较好。
vzv-ge糖蛋白由orf68编码，有623个氨基酸组成，为i型跨膜糖蛋白，由信号肽、胞外区、跨膜区和胞内区构成。ge糖蛋白在病毒和感染细胞表面表达最为丰富，并兼有t、b细胞表位，所以针对vzv-ge的研究最为广泛，期望其成为新一代的亚单位水痘或带状疱疹疫苗。也有研究者只截取ge的37-161氨基酸保守序列研制亚单位疫苗，但因其片段较小、涵盖表位较少、免疫原性弱而不利于应用。
真核细胞表达系统表达的蛋白表达量低、其蛋白糖基化不一致，导致蛋白有异质性差异，并且有些蛋白的免疫原性与糖基化并无紧密关联。据此，我们利用大肠杆菌表达系统表达目的蛋白，评价其免疫原性，为将来的疫苗研究打下基础。利用大肠杆菌表达系统表达目的蛋白，凸显了大肠杆菌表达系统蛋白表达量高、操作简便、工艺可控性强，易于实现自动化、无宿主细胞核酸及蛋白残留等特点。
技术实现要素：
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本发明提供一种水痘-带状疱疹病毒糖蛋白e胞外区蛋白的制备方法，利用大肠杆菌表达系统表达目的蛋白，凸显了大肠杆菌表达系统蛋白表达量高、操作简便、工艺可控性强，易于实现自动化、无宿主细胞核酸及蛋白残留等特点。
本发明公开的一种重组质粒载体，由已优化为大肠杆菌偏爱密码子的水痘-带状疱疹病毒糖蛋白e胞外区基因与表达载体pet-21b连接构建而成，其核酸序列如seqno.1所示，其对应的氨基酸序列如seqno.2所示。
本发明公开的一种转化体，其特征在于由上述的重组质粒载体转化大肠杆菌bl21(de3)获得。
本发明所述的一种制备水痘-带状疱疹病毒糖蛋白e胞外区蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤：
1）以优化为大肠杆菌偏爱密码子的合成质粒为模板，用两端设计为nhei和ecori酶切位点的引物进行pcr扩增，纯化pcr产物；
正向引物为（5'-3'）：tcctagctagcatgaccaatccggttcgcgccagcgtgc；反向引物为（5'-3'）：ttccggaattcttaatgatgatgatgatgatgacgcagcagcgggcttgtacccggat；
2）将步骤1）获得的pcr产物和pet-21b载体用内切酶nhei和ecori双酶切，再将酶切产物连接，构建重组质粒载体；将重组质粒载体转化大肠杆菌感受态细胞，经筛选得到阳性克隆。
3）将阳性克隆质粒转入bl21（de3）表达菌中，挑选克隆，诱导表达，获得阳性表达菌。
4）阳性表达菌大量扩增，在37℃用0.1-10mmiptg诱导4-6h，可获得vzv-ge胞外区蛋白。
本发明所述的一种水痘疫苗或者带状疱疹疫苗，是由按照本发明制备水痘-带状疱疹病毒糖蛋白e胞外区蛋白方法制备的vzv-ge胞外区蛋白抗原成分和疫苗佐剂配制而成。
本发明所述的一种联合疫苗或者多价疫苗，含有按照本发明制备水痘-带状疱疹病毒糖蛋白e胞外区蛋白方法制备的vzv-ge胞外区蛋白抗原成分与疫苗佐剂配制而成。
本发明提供了一种重组质粒载体，该载体是由水痘-带状疱疹病毒糖蛋白e胞外区基因与pet-21b载体连接而成；在此重组载体中含有的vzv-ge胞外区基因是优化为大肠杆菌偏爱密码子的基因序列；其中所述的vzv-ge胞外区基因可以是以合成质粒为模板，可以用pcr扩增获得；所述的载体可以是pet-21b等原核表达载体。所述的重组质粒载体构建过程中涉及的引物合成、pcr扩增等可以使用本领域内常规方法获得。所述的dna多聚酶、内切酶、连接酶可以使用常规的分子生物学工具酶，例如primestarhsdnapolymerase、nhei、ecori、t4dna连接酶等。其中所述的模板质粒含有的vzv-ge胞外区基因为优化为大肠杆菌偏爱密码子的基因序列。其中所述的连接可以使用本领域内常规方法获得。例如所述的连接可以是利用内切酶酶切处理含有vzv-ge胞外区基因两侧带有限制性酶切识别位点的克隆质粒而得到的vzv-ge胞外区基因，与经同样处理的表达载体pet-21b在室温条件下连接5-6h，或者16℃条件下过夜连接，构建重组表达质粒。
本发明提供了一种转化体，是由优化为大肠杆菌偏爱密码子的vzv-ge胞外区基因与重组表达载体pet-21b连接构建的重组表达质粒转化宿主细胞获得的，这种宿主细胞是感受态大肠杆菌bl21（de3）。所述的转化过程可以使用本领域内常规方法。
本发明提供了一种制备vzv-ge胞外区蛋白的方法，包括用本发明提供的由优化为大肠杆菌偏爱密码子的vzv-ge胞外区基因与重组表达载体pet-21b连接构建的重组表达质粒转化大肠杆菌，克隆培养并诱导表达vzv-ge胞外区蛋白，经纯化获得vzv-ge胞外区蛋白抗原。所述的克隆构建、转化、表达过程可以使用本领域内常规方法获得。
本发明提供了一种蛋白，其由vzv-ge胞外区基因编码，为vzv-ge胞外区蛋白，其氨基酸序列如图2所示。其制备方法可以包括以下步骤：将vzv-ge胞外区基因优化为大肠杆菌偏爱密码子，合成质粒puc-ge；以此合成质粒为模板，用两端设计为nhei和ecori酶切位点的引物进行pcr扩增，纯化pcr产物；将获得的pcr产物和pet-21b载体进行双酶切、连接，构建重组质粒载体；将连接产物转化至感受态大肠杆菌dh5a，筛选阳性菌；提取阳性菌质粒转化感受态表达菌bl21(de3)，挑取阳性菌诱导表达，经初步纯化获得vzv-ge胞外区蛋白抗原。
上述的vzv-ge胞外区蛋白抗原是由本发明提供的转化体经扩增培养、诱导表达、纯化而获得的。所述的培养过程可以使用常规摇床37℃条件下培养。所述的诱导可以使用常见的诱导剂iptg，使用浓度为0.1-10mm，诱导时间大于4小时。
本发明提供的蛋白表达为包涵体，可以利用常规的方法将包涵体提取，例如超声破碎、离心；可以利用常规的方法将包涵体溶解，例如8m尿素、6m盐酸胍；可以在常规的缓冲体系中进行初步复性和纯化，例如pbs、tris等缓冲体系。
本发明可以使用常规纯化方法纯化vzv-ge胞外区蛋白；可以用分子筛、离子交换层析和（或）金属离子螯合亲和层析的方法和其他已知或者常规的方法获得目的蛋白。
本发明提供的蛋白为vzv-ge胞外区蛋白，其氨基酸数量可以是546、544、539、537等。
本发明提供了一种制备水痘疫苗和带状疱疹疫苗的方法，将利用上述方法和过程制备的抗原蛋白，辅以单一佐剂或者复合佐剂，进行合理配比后制备的以vzv-ge胞外区蛋白为主要蛋白抗原的、以预防水痘或者带状疱疹为目的的疫苗。
本发明提供的蛋白是利用基因工程技术获得的重组蛋白抗原，此种蛋白抗原可以作为新一代水痘疫苗、带状疱疹疫苗的主要抗原成分，可以作为新一代联合疫苗、单（多）价疫苗的主要抗原成分，可以作为vzv相关研究中抗原、抗体定性、定量检测使用。例如，以此抗原作为包被抗原，进行抗原、抗体的定性研究和抗体效价研究；以此抗原为参考标准进行相关抗原的定性定量研究等。
本发明提供的蛋白具有较强的免疫原性。将此抗原辅以弗氏佐剂皮下免疫balb/c小鼠，加强后小鼠血清效价达到1:105以上。实验结果说明，利用本发明提供的方法和过程制备的vzv-ge胞外区蛋白抗原具有较好的免疫原性，可以用于水痘疫苗和带状疱疹疫苗等预防性疫苗候选疫苗和相关联合疫苗的研发。
本发明的积极效果在于：
重组载体和转化体具有高效表达vzv-ge胞外区蛋白，易于繁殖，安全性高等优点。本发明制备的重组蛋白抗原具有纯度好、免疫原性好、安全性好等优点。本发明提供的方法具有简单、高效的优点。利用本发明提供的抗原制备疫苗可以达到纯度高、质量可控、生产过程中无病毒操作过程、不用担心病毒突变和返祖现象发生等优势。
附图说明：
图1.vzv-gepcr扩增结果（lane1：dl5000；lane2：目的片段）；
图2.pet-21b-ge载体酶切鉴定结果（lane1：dl5000；lane2：重组质粒双酶切结果，目的片段大小符合预期）；
图3重组表达菌诱导表达结果（lane1：pagerulerplusprestainedproteinladder；lane2：未诱导组；lane3：诱导组，可见新增蛋白表达，大小符合预期）；
图4蛋白表达形式结果（lane1：pagerulerplusprestainedproteinladder；lane2：菌体破碎上清；lane3：菌体破碎沉淀，可见目的蛋白的表达形式为包涵体）；
图5目的蛋白的镍胶纯化结果（lane1：pagerulerplusprestainedproteinladder；lane2：穿柱；lane3：50mm咪唑洗脱液；lane4：100mm咪唑洗脱液；lane5：200mm咪唑洗脱液；lane6：300mm咪唑洗脱液；lane7：500mm咪唑洗脱液）；
图6目的蛋白wb鉴定结果（lane1：pagerulerplusprestainedproteinladder；lane2：目的蛋白）。
具体实施方式
下面的具体实施例将对本发明做进一步描述，具体实施例并不是要对本发明作进一步限定。但是根据本发明所做的同义替换或相应的改进，仍然属于本发明的保护范围。
实施例1
水痘-带状疱疹病毒糖蛋白e蛋白抗原的制备
1、目的基因扩增
（1）引物设计
根据genbank上公布的水痘-带状疱疹病毒糖蛋白e基因序列，选取氨基酸序列25-537对应的核酸序列设计两端带有nhei和ecori酶切位点（斜体标出）的引物：
正向引物为（5'-3'）：tcctagctagcatgaccaatccggttcgcgccagcgtgc；
反向引物为（5'-3'）：ttccggaattcttaatgatgatgatgatgatgacgcagc
agcgggcttgtacccggat；
（2）pcr扩增
以合成的质粒为模板，使用上述引物进行核酸扩增，具体反应体系为primestarhsdnapolymerasebuffer（5×）10ul，dntps4ul，primer-f1ul，primer-r1ul，模板1ul，primestarhsdnapolymerase0.5ul，加入去离子水至总体积50ul；将反应管放入pcr仪中，先94℃预变性5min，再94℃变性30sec、55℃退火30sec、68℃延伸2min，此循环进行35个循环，最后72℃延伸10min，扩增得到目的片段符合预期，结果见图1；
2、pcr产物的克隆与测序
（1）pcr产物与载体双酶切
将目的基因的pcr产物30ul或pet-21b载体5ul，分别加入10xkbuffer5ul，nhei内切酶、ecori内切酶各1ul，加去离子水至50ul，37℃水浴2h；
（2）pcr产物与克隆载体的连接
将目的基因和载体酶切回收产物定量后，分别取10ul和2ul，加入10×t4连接酶buffer2ul，t4连接酶1ul，室温连接6h，得到连接产物pet-21b-ge537；
（3）转化与筛选
将连接产物10ul转化到100ule.colidh5α感受态细胞中，涂板，37℃培养过夜。挑选单克隆菌落，提取质粒进行双酶切鉴定，选择阳性克隆，结果见图2；
3、转化体的构建及目的基因的表达鉴定
（1）将测序正确的表达质粒转化到e.colibl21（de3）表达菌株中；
（2）重组蛋白在大肠杆菌bl21(de3)中的诱导表达
在lb固体培养平板（amp+）上挑选单克隆，接种到4mllb液体培养基（amp+）中，37℃/220rpm摇菌4h；在每组4ml菌液中取出2ml，加入另一中试管中，按1:1000加入iptg（诱导后），并和原管（诱导前）一起继续培养4h；在每组诱导前和诱导后试管中各取200ul菌液，加入到1.5mlep管中，12000rpm离心10min，弃净上清；用80ul1×sds上样缓冲液悬起菌体进行sds-page分析，结果见图3；
（3）重组蛋白表达形式的鉴定
将5ml过夜菌接种至100mllb培养基中，37℃/220rpm摇菌至od600达到0.4左右，加入0.1mmiptg诱导表达，4h收获菌体；将菌体用20ml20mmtris(ph7.5)悬起，洗涤3次；再用20ml菌体裂解液（20mmtris+2mmedta+0.1%dtt，ph7.5）悬起，冰浴超声（60%amp，5secon，10secoff，15min），破碎菌体。4℃，8000rpm，离心30min，分别取上清和沉淀进行sds_page，结果见图4；
4、重组蛋白的纯化
（1）目的蛋白的纯化
按照3（2）步骤和参数提取包涵体。将包涵体用20ml溶解液（20mmtris+8murea+2mmedta，ph8.0）悬起，室温溶解2h以上。将包涵体溶解液10000rpm，离心1h，取上清；将上清液配制成上样样品（20mmtris+300mmnacl+2mmedta+8murea+50mm
nah2po4，ph8.0）。取ge公司ni-sepharosefastflow6ff1ml，加入到上样样品中，室温混合2h；将样品加入到回收柱中，并依次用含有50mm、100mm、200mm、300mm、500mm咪唑的洗脱缓冲液洗脱（咪唑+20mmtris+8murea+300mmnacl+50mmnah2po4，ph8.0），回收洗脱样品，进行sds-page，结果见图5；
（2）蛋白复性
将（2）中含300mm咪唑洗脱液洗脱的蛋白依次在含有6m、4m、2m、0m尿素的20mmpbs缓冲液中4℃透析过夜，将透析样品8000rpm离心30min，收取上清，即为目的蛋白；
5、目的蛋白的wb鉴定
将目的蛋白进行sds-page，再进行wb鉴定，结果见图6。
实施例2
水痘-带状疱疹病毒糖蛋白e胞外区蛋白抗原的制备
（1）引物设计
根据genbank上公布的水痘-带状疱疹病毒糖蛋白e基因序列，选取氨基酸序列25-539对应的核酸序列设计两端带有nhei和ecori酶切位点（斜体标出）的引物：
正向引物为（5'-3'）：tcctagctagcatgaccaatccggttcgcgccagcgtgc；反向引物为（5'-3'）：ttccggaattcttaatgatgatgatgatgatgcgcataacgcagcagcgggcttgtac；
（2）pcr产物与克隆载体的连接
根据设计的引物扩增目的片段，经回收后分别与载体进行酶切，将目的基因和载体酶切回收产物定量后，分别取12ul和2ul，加入10×t4连接酶buffer2ul，t4连接酶1ul，加入去离子水至20ul，16℃条件下过夜连接，得到重组载体pet-21b-ge539；
（3）重组蛋白在大肠杆菌bl21(de3)中的诱导表达
将重组载体转化bl21(de3)菌体，获得转化体。在lb固体培养平板（amp+）上挑选转化体单克隆，接种到4mllb液体培养基（amp+）中，37℃/220rpm摇菌4h；在每组4ml菌液中取出2ml，加入另一中试管中，按1:1000加入iptg（诱导后），并和原管（诱导前）一起继续摇菌4h；在每组诱导前和诱导后试管中各取200ul菌液，加入到1.5mlep管中，12000rpm离心10min，弃净上清；用80ul1×sds上样缓冲液悬起菌体进行sds-page分析；
（4）重组蛋白的纯化
将转化体在37℃条件下扩增，用1mmiptg诱导6h，收获菌体，超声破碎后鉴定，目的蛋白以包涵体形式表达。将包涵体用20ml溶解液（20mmpb+8murea+2mmedta，ph8.0）悬起，室温溶解过夜。将包涵体溶解液10000rpm，离心1h，取上清。将此上清液配制成上样样品（20mmpb+300mmnacl+2mmedta+8murea，ph8.0）。取ge公司ni-sepharosefastflow6ff1ml，加入到上样样品中，室温混合2h；将样品加入到回收柱中，并依次用含有50mm、100mm、200mm、300mm、500mm咪唑的洗脱缓冲液洗脱（咪唑+8murea+300mmnacl+20mmpb，ph8.0），回收洗脱样品，进行sds-page。结果可见300mm咪唑洗脱液中洗脱了大部分目的蛋白；
将含300mm咪唑洗脱液洗脱的蛋白依次在含有6m、4m、2m、0m尿素的20mmpbs缓冲液中4℃透析过夜，将透析样品8000rpm离心30min，收取上清，即为目的蛋白。
实施例3
水痘-带状疱疹病毒糖蛋白e胞外区蛋白抗原的制备
1、引物设计
根据genbank上公布的水痘-带状疱疹病毒糖蛋白e基因序列，选取氨基酸序列25-546对应的核酸序列，设计两端带有nhei和ecori酶切位点（斜体标出）的引物，
正向引物为（5'-3'）：tcctagctagcatgaccaatccggttcgcgccagcgtgc；
反向引物为（5'-3'）：ttccggaattcttaatgatgatgatgatgatggcccagg
cccgcggtccacgccgca；
2、pcr产物与克隆载体的连接
根据设计的引物扩增目的片段，经回收后分别与载体进行酶切，将目的基因和载体酶切回收产物定量后，分别取12ul和2ul，加入10×t4连接酶buffer2ul，t4连接酶1ul，加入去离子水至20ul，16℃条件下过夜连接，得到重组载体pet-21b-ge546；
3、重组蛋白在大肠杆菌bl21(de3)中的诱导表达
将重组载体转化bl21(de3)菌体，获得转化体；在lb固体培养平板（amp+）上挑选转化体单克隆，接种到4mllb液体培养基（amp+）中，37℃/220rpm摇菌4h；在每组4ml菌液中取出2ml，加入另一中试管中，按1:1000加入iptg（诱导后），并和原管（诱导前）一起继续摇菌4h；在每组诱导前和诱导后试管中各取200ul菌液，加入到1.5mlep管中，12000rpm离心10min，弃净上清；用80ul1×sds上样缓冲液悬起菌体进行sds-page分析；
4、重组蛋白的纯化
将转化体在37℃条件下扩增，用10mmiptg诱导6h，收获菌体，超声破碎后鉴定，目的蛋白以包涵体形式表达。将包涵体用20ml溶解液（20mmpb+8murea+2mmedta，ph8.0）悬起，室温溶解过夜。将包涵体溶解液10000rpm，离心1h，取上清。将此上清液配制成上样样品（20mmpb+300mmnacl+2mmedta+8murea，ph8.0）。取ge公司ni-sepharosefastflow6ff1ml，加入到上样样品中，室温混合2h；将样品加入到回收柱中，并依次用含有50mm、100mm、200mm、300mm、500mm咪唑的洗脱缓冲液洗脱（咪唑+8murea+300mmnacl+20mmpb，ph8.0），回收洗脱样品，进行sds-page。结果可见300mm咪唑洗脱液中洗脱了大部分目的蛋白；
将300mm咪唑洗脱液依次在含有6m、4m、2m、0m尿素的20mmpbs缓冲液中4℃透析过夜，将透析样品8000rpm离心30min，收取上清，即为目的蛋白。
seqno.1
<110>长春祈健生物制品有限公司
<120>
<140>
<160>1
<210>1
<211>37
<212>protein
<213>vzv-ge胞外区蛋白
<400>1
atgaccaatccggttcgcgccagcgtgctgcgctacgacgatttccacattgacgaggacaagctggacaccaatagcgtgtacgagccgtactaccatagcgaccatgcagaaagcagctgggttaaccgtggtgaaagcagccgtaaagcctacgaccacaatagcccgtatatttggccgcgcaacgactatgatggtttcctggagaacgcccatgaacaccacggcgtgtacaatcagggccgcggcatcgatagtggtgagcgtctgatgcagccgacccagatgagcgcccaggaagatctgggcgatgataccggcatccatgtgatcccgaccctgaatggcgatgatcgtcataaaatcgttaatgtggatcaacgccagtacggcgacgtgtttaaaggtgacctgaacccgaaaccgcaaggccaacgcctgattgaggtgagcgtggaggaaaatcacccgttcacattacgtgccccgatccagcgtatttacggtgtgcgctataccgaaacctggagctttctgccgagcctgacctgtaccggtgatgcagccccggccatccagcatatctgcctgaagcataccacctgttttcaggatgtggttgtggacgtggactgcgcagaaaacaccaaagaagatcagctggccgaaattagctatcgctttcagggcaaaaaagaagctgatcagccgtggattgtggtgaacaccagcaccctgtttgacgagctggaactggatccccctgaaattgagccgggcgtgctgaaagtgctgcgtaccgaaaagcagtatttaggcgtttacatctggaacatgcgcggtagcgatggcaccagcacctatgccacctttctggtgacctggaagggtgacgagaaaacccgtaaccctaccccggccgttacacctcaaccgcgcggtgcagaatttcatatgtggaattatcatagtcacgtgttcagtgtgggcgataccttcagcctggccatgcacctgcagtataaaatccacgaagccccgttcgatctgctgctggagtggctgtatgttccgatcgatccgacctgtcagccgatgcgtttatacagcacctgcctgtaccatccgaatgccccgcaatgtctgagtcacatgaatagcggctgcacctttaccagcccgcatctggcacagcgtgtggccagcaccgtgtatcagaactgcgagcatgccgataactataccgcctactgtctgggcattagccacatggagccgagttttggtctgatcctgcacgacggcggcacaaccttaaaatttgtggacaccccggaaagtctgagcggcctgtatgtttttgttgtgtattttaacggtcacgtggaggccgtggcctataccgtggtgagcaccgtggaccacttcgtgaacgcaatcgaagaacgtggcttcccccctacagcaggtcagccgccggcaaccacaaagccgaaagagattaccccggtgaatccgggtacaagcccgctgctgcgttaa
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<110>长春祈健生物制品有限公司
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