本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种调控拟南芥苗期营养体大、早花和粒重增加的玉米基因zmgras37及其应用。
背景技术：
我国黄淮海区域的农业生产主要是小麦和玉米的轮作。由于玉米的生产趋向于麦收后机器直播和成熟后机器收获，育种工作中迫切需要培育生育期短的玉米品种。作物营养体大能够显著地增加作物的光合效率，提高以获得营养体为目的的作物的产量；适度的早花能够缩短作物的生育期，提高品种的适应性，因而是重要的作物农艺性状。因此获得更多的营养体大、早花以及粒重增加的转基因作物，可以显著地促进玉米、水稻等禾本科植物的分子设计育种工作。
gras蛋白是植物中特有的蛋白家族，它的名字来源于植物界中首先发现的三个gras蛋白成员gai[ga(gibberellicacid)-insensitive],rga(repressorofgai)和scr(scarecrow)(pyshetal.,1999)。gras基因家族被称为基因的“绿色革命”，对该家族的研究已经有超过十年的历史，目前发现gras蛋白家族涉及到植物转录水平调控和控制植物生长发育的多种信号转导途径(bolleetal.2004)。目前，在294种陆生植物中已经发现，gras基因具有1035种序列(sunetal.2012)。对不同物种的gras蛋白进行的分析揭示了它们具有一个相似的亚家族分支，包括十个亚家族，这些亚家族的名称是以家族内部的一个成员或者一个通用的基序来命名的，分别是：atlas(arabidopsislateralsuppressor),atscl(arabidopsisscr-like),ham(hairymeristem),atscr(arabidopsisscr),dlt(dwarfandlowtillering),atscl3,della,atpat1[arabidopsispat(phytochromeasignaltransduction)1-1],atshr[arabidopsisshr(shortroot)]andliscl(liliumlongiflorumscr-like)(bolleetal.2004,tianetal.2004,sunetal.2011,limetal.2005,sanchezetal.2007)。目前仍然有一部分gras蛋白还没有发现合适的亚家族，需要后续的研究。
gras蛋白家族各成员在核苷酸序列和长度上存在很大的差异，主要不同的地方集中在n端，包含由脯氨酸、谷氨酸、酪氨酸、丝氨酸、甘氨酸、天冬氨酸以及丙氨酸等组成的同性聚合结构域，但是它们的c端具有很高的同源性，c端保守序列主要有：leucineheptadrepeat
除了特定基序的存在证明gras家族成员可以作为转录调控因子（pyshetal.2000,bolle2004）外，大部分gras蛋白的核定位也可以说明这一点。除了pat1亚家族之外，其他gras转录因子家族成员大部分都含有一个入核信号（nls）（bolle2004），因此gras蛋白能否作为转录调控因子的条件之一就是其是否具有核定位信号。
gras转录因子家族蛋白涉及植物生长的各个方面，在多个生长过程中起调节作用，包括激素的信号传导、植物形态发育建成等多个过程。主要包括以下方面：
（1）gras转录因子蛋白涉及根的生长。第一个发现的gras基因家族成员atscr基因的突变体，由于该基因的功能缺失导致根的生长异常，scr基因的功能与根部皮层细胞的不对称分裂以及根的辐射生长相关。此外，另一个gras转录因子家族成员shortroot（shr）基因也被证明与根的辐射生长相关。
（2）gras转录因子家族与腋生分生组织的生长相关。schumacher等人在1999年的工作中提到的番茄ls基因的功能缺失突变体表现出植物无分枝，腋芽分生组织早期的发育被阻断，而ls基因的结构中包含gras转录因子家族的vhiid基序，充分证明gras转录因子家族与腋生分生组织的生长有关。该基因在拟南芥中和水稻中的同源基因atlas/scl1和osmoci功能缺失的突变体同样表现出腋芽不能萌发。这也说明gras转录因子家族与腋生分生组织的生长有密切关系。
（3）gras转录因子家族与茎顶端分生组织的特性保持相关。ham亚家族是gras亚家族成员之一，stuurman等人在2002年发现的矮牵牛hairymeristem（ham）的突变体中发现其不再保持茎顶端分生组织无差别的特性，茎顶端分生组织和腋生分生组织的生长停止导致植物器官发育的停止，此外，ham突变体形成了比野生型更小的叶子。说明ham亚家族在分生组织生长的某个途径中起着重要作用。
（4）gras家族成员涉及植物光敏色素信号的传导过程。pat1亚家族是gras家族重要成员，拟南芥pat1的突变体使其光敏色素a的信号传导过程异常，查尔酮合成酶与叶绿素合成蛋白的表达受到严重影响，同时导致突变体的下轴延长，但在其他光下没有受到影响，因此pat1基因专一的与光敏色素a的信号传导相关。
（5）gras家族成员与赤霉素信号传导相关。赤霉素一般促进茎的伸长、花的形成以及种子的萌发过程。gras基因家族中的gai表达产物在赤霉素信号传导过程中起着负调控的作用，参与赤霉素信号传导过程的gras蛋白之间的同源性（55%-76%）要比与其他的gras蛋白成员的同源性（20%-27%）要高许多。这也证明这部分蛋白参与赤霉素信号传导的过程。
（6）gras蛋白家族可以作为转录因子起作用。除了pat1亚家族是细胞质定位的蛋白外，大部分gras蛋白都是核定位的蛋白。在最近的研究中发现gras蛋白结构中有一些核定位信号，这也为gras蛋白作为转录因子起作用提供了更为充分的证据。
gras家族基因在植物的生长发育过程中起着非常重要且独特的作用。因此，对于gras家族蛋白的研究具有十分重要的意义。而对玉米中gras家族成员的研究并不深入，玉米中的gras家族成员在生长发育方面目前缺乏能够公开检索到的文献。
技术实现要素：
针对上述现有技术的情况，本发明的目的是提供了一种调控拟南芥苗期营养体大、早花和粒重增加的玉米基因zmgras37及其应用，本发明从玉米中分离和克隆到gras37基因，并将其命名为zmgras37，将zmgras37的全长cdna连接到35s启动子启动的表达载体ppzp211上，利用农杆菌侵染转化拟南芥，发现该基因可以使模式植物拟南芥苗期出现营养体大、早花和粒重增加的表型。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明提供了一种调控拟南芥苗期营养体大、早花和粒重增加的玉米基因zmgras37，其核苷酸序列如seqidno:1所示，cds序列如seqidno:2所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如序列seqidno:3所示。
扩增所述zmgras37基因的引物序列为：
上游引物5’-ggtaccatggccgccgagccggcggatgtc-3’；
下游引物5’-aagctttcattttgcagcccacgcagacat-3’。
本发明还提供了所述的基因zmgras37在调控植物苗期营养体大表型中的应用。
进一步的：zmgras37转基因阳性拟南芥植株在苗期与野生型相比叶片直径、叶片的细胞均变大，鲜重、干重均增加。
本发明还提供了所述的基因zmgras37在调控植物早花表型上的应用。
进一步的：zmgras37转基因阳性拟南芥植株与野生型相比开花时间提前三天。
本发明还提供了所述的基因zmgras37在调控植物粒重增加表型上的应用。
进一步的：zmgras37转基因阳性拟南芥植株与野生型相比种子直径增加且千粒重增加。
与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：本发明将zmgras37基因全长cdna连接到过表达载体启动的表达载体上，利用农杆菌侵染转化拟南芥，发现该基因过表达可以使模式植物拟南芥苗期出现营养体大、早花和粒重增加等表型，进化树分析结果显示，模式植物拟南芥中无该基因的直接同源基因，但该基因与禾本科植物高粱、玉米的同源性较高，说明该基因是禾本科植物所特有的gras家族基因；文献检索没有发现关于该基因功能方面的研究。鉴于该基因在禾本科植物中的保守性以及在转基因拟南芥中呈现的表型，认为该基因具有潜在的应用价值。
附图说明
图1是玉米、拟南芥、水稻以及高粱中gras蛋白家族成员所构建的进化树。
图2是构建的表达载体的示意图以及酶切位点。其中，表达载体为ppzp211，启动子为35s，目的基因zmgras37两端的酶切位点分别为kpn1和hindⅲ。
图3a条带为克隆到的目的基因zmgras37的示意图，大小为2001bp；图3b条带为目的基因连接peasy-t1克隆载体所得到的阳性克隆；图3c为测序正确的带有gras37基因的克隆载体质粒酶切结果示意图；图3d为目的基因连到ppzp211表达载体所得到的阳性克隆；图3e为带有gras37基因的表达载体质粒酶切结果示意图。
图4为转基因株系阳性苗的鉴定；1号泳道为野生型wt，其余泳道为转基因株系。
图5a为转基因株系35s::zmgras37与野生型wt在不同时间（从左到右分别为种植后生长14、18、21天）同一钵中种植的表型图。
图5b为转基因株系35s::zmgras37与野生型wt在不同时间（种植后生长14、18、21、28天）不同花钵中单株种植的表型图。
图6a为转基因株系35s::zmgras37与野生型wt在生长18天（35s::zmgras37露出花芽）时的表型图。
图6b为转基因株系35s::zmgras37与野生型wt在生长18天（35s::zmgras37露出花芽）时直径的数据统计，且发现具有显著性差异。
图6c分别为转基因株系35s::zmgras37与野生型wt在生长18天（35s::zmgras37露出花芽）时鲜重以及干重（80摄氏度烘24小时）的数据统计，且发现具有显著性差异。
图7a为微分干涉差显微镜下转基因株系35s::zmgras37与野生型wt铺板细胞的表型图。
图7b为实体解剖镜下转基因株系35s::zmgras37与野生型wt叶片大小的表型图。
图7c为a视野下铺板细胞数目的数据统计。
图7d为b视野下叶片面积的数据统计。
图7e图为两者叶片中总铺板细胞的数据统计。
图8a为转基因株系35s::zmgras37与野生型wt在生长21天（wt露出花芽）时的表型图。
图8b、c为转基因株系35s::zmgras37与野生型wt早花数据的统计。
图8d为转基因株系35s::zmgras37与野生型wt中五个与开花相关基因的表达量的qrt检测结果。
图9a为实体解剖镜下转基因株系35s::zmgras37与野生型wt种子的大小。
图9b为二者千粒重的统计。
具体实施方式
以下实施例中进一步解释说明本发明的技术方案，根据以上的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件；本发明将上述表达载体导入到模式植物拟南芥细胞中，导入方法为农杆菌介导的转化法。其中将上述表达载体导入植物细胞中，导入方法都是本领域人员熟知的，这些方法包括但不仅限于：农杆菌介导的转化法、基因枪法、电激法、子房注射法等。本发明选用的筛选阳性苗的抗生素为卡那霉素；除此之外，本发明所采用的均为本领域现有技术。
本发明首先从玉米中获取了总rna，反转录获得cdna第一链，之后利用其作为模板，用zmgras37对应的特异性引物对获得的cdna进行phusion高保真酶扩增。
玉米rna的提取和纯化可直接采用现有工艺，也可采用本发明中所记载的工艺；cdna第一链的合成的也是相同的情况，也可以采用现有的工艺或者试剂盒，但是上述两者均优选采用本发明所记载的具体工艺。
实施例1：转基因株系的获得
（一）玉米gras37基因的序列分析、克隆与载体构建
本发明利用玉米基因组数据库网站maizegdb找到基因gras37，利用ncbi分析可知此基因与所有的gras蛋白家族成员一样，均拥有一个保守的c端gras结构域；gras37基因组序列全长为2258bp（序列如seqidno.1所示），而cds序列为2001bp（序列如seqidno.2所示），将gras37的氨基酸序列（序列如seqidno.3所示）与玉米、拟南芥、水稻以及高粱中所有gras蛋白家族成员构建进化树，结果如图1所示。图1进化树分析结果显示，拟南芥中无该基因的直接同源基因，但该基因与禾本科植物高粱的同源性较高，因此说明该基因是禾本科植物所特有的一个基因。
根据找到的玉米gras37基因的cds序列设计引物，进行克隆，克隆方法如下：
（1）rna的提取：使用康为世纪trizon提取玉米的总rna。
1．取新鲜植物组织材料在液氮中充分研磨，每30-50mg组织加入1mltrizon，漩涡振荡混匀，室温放置5分钟，使蛋白核酸复合物完全分离。
2．4℃，12000g离心10分钟，取上清至新的rnase-free离心管中。
3．向上述离心管中加入400µl氯仿，剧烈震荡15秒，室温放置2-3分钟。(可用氯仿抽提两次)。
4．4℃，12000g离心15分钟，液体分层，将最上层无色水相转移至一新rnase-free离心管中。
5．加入等体积异丙醇，颠倒混匀，室温放置10分钟。
6．4℃，12000g离心10分钟，弃上清。
7．加入1mlrnase-free水配制的75%乙醇（现用现配），洗涤沉淀。（可洗涤两次）。
8．4℃，12000g离心5分钟，弃上清（尽量将上清全部吸干），室温干燥5-10分钟，加入30-100µl无rnase的水溶解沉淀，沉淀溶解后可置于-80℃冰箱长久保存。
（2）反转录cdna第一链的合成：将提取的rna溶解后测定rna浓度，然后使用transscriptone-stepgdnaremovalandcdnasynthesissupermix反转录试剂盒进行反转录。
取5μg总rna，加入2×反应缓冲液10μl，引物oligodt（0.5μg/μl）1μl，反转录酶1μl，去基因组酶1μl，补水到20μl，在42℃孵育30分钟，85℃酶失活5分钟。
（3）gras37基因的克隆：
gras37基因引物序列：
上游引物5’-ggtaccatggccgccgagccggcggatgtc-3’；（seqidno.4）；
下游引物5’-aagctttcattttgcagcccacgcagacat-3’；（seqidno.5）；
其中下划线处为酶切位点，上游引物的酶切位点为kpn1，下游引物的酶切位点为hindⅲ。
使用phusion高保真酶进行扩增，反应体系为：10×反应缓冲液2.5μl，脱氧核糖核酸（dntp）2μl，上游引物1μl，下游引物1μl，phusion高保真酶0.5μl，dmso0.75μl，cdna模板1μl，水补齐到25μl。
pcr反应条件为：95℃预变性5分钟；
95℃变性15秒，58℃退火15秒，72℃延伸2分钟，共35个循环；
72℃后延伸5分钟；
16℃保温。
反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，检测到目的条带后，如图3a所示，切胶并进行胶回收，胶回收方法根据bioteke公司的快捷型琼脂糖凝胶dna回收试剂盒（cat#dp1722）进行。
高保真酶扩增的产物末端为平末端，需要添加polya后才能进行t-a克隆，反应体系如下：10×反应缓冲液1.5μl，脱氧核糖核酸（dntp）1.2μl，easytaq酶0.15μl，胶回收产物补齐15μl。之后再72℃反应30分钟。
（4）取上述4μl加尾产物与peasy-t1克隆载体进行连接，操作步骤按照全式金公司的产品peasy-t1说明书进行，然后连接产物使用热激法转化大肠杆菌dh5α菌株，在含有卡那霉素的lb平板上生长过夜。挑取白色单个菌落在lb平板上划线，进行菌落pcr，反应体系如上，选取阳性菌落在lb液体培养基中过夜，如图3b所示。
（5）质粒dna的提取：使用康为世纪高纯度质粒小提取试剂盒（cw0500a）提取质粒dna。
（6）序列测定：本工作在北京六合华大基因科技股份有限公司进行。
（7）表达载体的构建：用kpn1和hindⅲ酶切测序正确的带有gras37基因的质粒如图3c所示和带有35s的ppzp211空载体，37℃酶切一个小时之后，进行琼脂糖凝胶电泳，切除正确的条带进行胶回收，将胶回收产物用thermo公司的t4dna连接酶连接，连接产物转化dh5α菌株，在含有spe的lb平板上生长过夜。挑取白色单个菌落在lb平板上划线，进行菌落pcr，选取阳性菌落在lb液体培养基中过夜，如图3d所示。质粒dna的提取：使用康为世纪高纯度质粒小提取试剂盒提取质粒dna，酶切鉴定，如图3e所示。构建得到35s::gras37的过表达载体。
（8）取2.5μl质粒转化农杆菌eha105，准备侵染拟南芥。
（二）：拟南芥花序侵染、过表达zmgras37转基因拟南芥阳性苗的筛选
（1）拟南芥花序侵染
侵染液配方（5ml体系）；
蔗糖0.25gsilwet（有毒，避光）1.5ulddh2o定容至5ml；
侵染步骤：
1.挑选pcr和酶切鉴定呈阳性农杆菌单菌落，加20ml左右lb(壮观霉素加利福平)培养基中，过夜培养。
2.拟南芥开花时间一般在11-13点，待侵染的苗子要求潮湿条件；因此应在上午9-10点左右将待侵染的苗子浇足水。
3.室温条件下，5000rpm，离心5分钟，收集菌体2-3次，用8-10ml侵染液重悬菌体。
4.中午前后，将已经开了的花浸入侵染液中6-7秒，间隔5-7天后可二次侵染以提高侵染效率。
5.暗处理，潮湿包裹24小时。
（2）转基因阳性苗的筛选
1.单株收到侵染后的拟南芥的种子为t0代。
2.t0代种子在含有卡那霉素的培养基上培养，挑选绿苗种在基质中，单株收到的种子为t1代。
3.t1代种子在含有卡那霉素的培养基上培养，挑选绿苗：黄苗约为3：1的株系中的绿苗种在基质中，单株收到的种子为t2代。
4.t2代种子在含有卡那霉素的培养基上培养，挑选全部是绿苗的株系种在基质中，收到的种子即为纯合的转基因株系的种子，提取转基因株系的基因组，用pcr检测转基因株系，结果如图4所示。
以下所有实验均选用纯合的转基因株系的种子。
实施例2：转基因株系在苗期具有营养体大的表型
（一）：过表达zmgras37转基因拟南芥的培养
拟南芥种子用现配的70%乙醇消毒5分钟，然后用2.6%的次氯酸钠消毒10分钟，最后用含有tween-20的ddh2o冲洗5-7次，将消毒的无菌种子平铺在1/2ms固体培养基上。4℃避光处理3天，放置于22℃的长日照培养箱生长7天，然后将拟南芥幼苗转入含有营养液的基质中继续培养。长日照条件为16h光照/8h黑暗，22℃。
实验结果如图5和图6所示，图5a、b均可说明转基因阳性植株在苗期具有营养体大的表型。图6a、b、c均可说明转基因阳性植株在苗期具有营养体大的表型。
（二）：过表达zmgras37转基因株系铺板细胞形态、大小观察
（1）脱色、透明
1.分别取新鲜的wt、zmgras37的叶片浸入14%冰醋酸、84%无水乙醇的混合溶液中过夜，进行脱色。
2.将样本分别在70%、99.5%的无水乙醇中各清洗两次。
3.将清洗好的叶片放入以下溶液中进行透明：水合氯醛200g、甘油20g、蒸馏水50g。
(2)制片、观察
材料放置时间长一些，3-4天左右，观察之前将材料捞出放在70%的无水乙醇中进行漂洗，10%的甘油进行压片，用微分干涉差显微镜（dic）进行观察。
实验结果如图7所示，从图7可以得出结论，过表达株系铺板细胞要比wt大，但是数目并没有明显差别，从而造成过表达株系的叶片要比wt大。
实施例3：转基因株系具有早花的表型
（一）：过表达zmgras37转基因株系开花基因表达量检测
依据qrt-pcr引物设计要求，使用beacondesigner7和primerpremier5.0等软件设计基因特异引物。选择sybrgreendesign选项，建立文件，输入序列，运行blast
searchsequence和templatestructuresearch工具后，运行primersearch工具，选择最优引物序列（先保证引物特异性再考虑避开模板结构影响）。引物在上海生工生物工程服务有限公司合成，采用page纯化。
应用qrt-pcr专用96孔板（axygen，美国）和高透光率封口膜（axygen，美国），荧光定量pcr仪icyclerreal-timepcrsystem（bio-rad，美国）进行qrt-pcr分析，每个样品3次重复。反转录产物为模板，反应体系参照sybrgreenrealtimepcrmastermix（qpk-201）说明书，反应条件如下：
（1）95.0℃60s；（2）95.0℃10s；（3）58.0±5.0℃10s；（4）72.0℃15s；（5）plateread；（6）incubateat65℃for20s；（7）meltingcurvefrom65℃to95℃，readevery0.5℃，hold1s；（8）end；其中（2）（3）（4）50-60cycles。
将多个样品混合，进行第一次扩增，检测引物是否可用，根据融解曲线验证引物扩增的特异性，单一峰即认为特异扩增，如有双峰，适当调整退火温度及引物用量，若仍然不能特异扩增，重新设计引物。使用混合模板按10倍浓度依次稀释，共稀释4次，用5个浓度的样品构建相对标准曲线，验证所有引物的扩增效率，以及目的序列在此浓度范围内是否具有线性扩增的关系。
以tubulin为内参，调整各模板浓度使内参ct值之差小于2。每个基因扩增均有内参同时扩增，默认条件下读取ct值，每个样品作三次重复，数据分析采用双标准曲线法，计算平均表达量和相对偏差，用excel作图。同时利用2-δδct大致计算与内参的相对表达量，确定基因的表达丰度。相对表达量计算foldchange=2–△△ct，此处△△ct=(ct-gen–ct-tubulin)处理–(ct-gene–ct-tubulin)对照。
实验结果如图8所示，图8b显示的是二者开始露出花芽时莲座叶的数目，发现莲座叶数目并没有明显的差别；图8c图显示的是两者开始露出花芽的时间，可以看出转基因阳性植株开花时间比野生型早3天。图8d显示抑制开花基因flc的表达量显著下调，促进开花基因中ft的表达量显著上调，其余三个促进开花的基因表达量变化不明显。综上所述，转基因株系35s::zmgras37与野生型wt相比具有早花的表型。
实施例4：转基因株系具有粒重增加的表型
（一）：过表达zmgras37转基因株系种子形态、粒重统计
实体解剖镜下进行转基因株系35s::zmgras37与野生型wt种子形态的观察，如图9a所示；万分之一精度的电子天平对两者进行千粒重统计，如图9b所示。图9实验结果表明过表达株系种子要比wt大。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
sequencelisting
<110>山东农业大学
<120>一种调控拟南芥苗期营养体大、早花和粒重增加的玉米基因zmgras37及其应
用
<130>
<160>5
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>2258
<212>dna
<213>玉米
<400>1
cgaccatggccgccgagccggcggatgtcggcgactccgagcccgagcccttctccccgt60
cggacttcctcaaccttggtcccccaacgcctcgcctcgacagccccgccctgcagctgc120
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<210>2
<211>2001
<212>dna
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