本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种microrna-126-5p的靶基因结合序列、重组载体、转化体及应用。
背景技术：
micrornas为一类小分子非编码rna，其长度约为18-22个核苷酸。成熟的microrna能与mrna3′端的非翻译区(3′untranslatedregion，3′-utr)特异结合，通过降解特异mrna或抑制其翻译在转录后水平调节靶基因的表达。但目前许多microrna在疾病发生发展中的靶基因及功能是不为人所知的。
microrna-126-5p基因定位于表皮生长因子样结构域7(epidermalgrowthfactorfactor-likedomain7,egfl7)基因7号内含子。目前研究发现microrna-126-5p在心血管系统中具有特异性表达，参与血管内皮细胞炎症性损伤与修复过程，进而在血管形成方面起着非常重要的作用，因而与高血压、动脉粥样硬化、冠心病、心力衰竭等心血管疾病的发生发展密切相关。
然而，现有技术并不知晓microrna-126-5p基因在心血管疾病发生发展中的作用靶基因结合序列，限制了其在心血管疾病诊断、治疗、机理研究方面的应用，因此，明确microrna-126-5p的靶基因结合序列，对今后开发其抑制药物具有非常重要的临床意义，将大大促进microrna-126-5p在心血管疾病的预防、诊断及治疗等中的应用。
技术实现要素：
本发明提供的一种microrna-126-5p的靶基因结合序列、重组载体、转化体及应用，有助于今后开发其抑制药物，将大大促进microrna-126-5p在心血管疾病的预防、诊断及治疗等中的应用。
本发明的第一个目的是提供一种microrna-126-5p的靶基因结合序列，所述靶基因结合序列的核苷酸序列如seqidno.1所示，并且所述靶基因结合序列位于hspb8mrna3’utr基因的第786-793位，其中所述hspb8mrna3’utr基因的核苷酸序列如seqidno.2所示。
本发明的第二个目的是提供一种包含权利要求1所述的靶基因结合序列的重组载体，所述重组载体是将如seqidno.2所述hspb8mrna3’utr核苷酸序列插入pgl3-lucpromoter载体中得到的重组pgl3-hspb8-3’utr载体。
优选的，所述重组载体中含有萤火虫荧光素酶或海洋腔肠荧光素酶报告基因。
本发明的第三个目的是提供一种包含权利要求2或3所述的重组载体的转化体。
本发明的第四个目的是提供一种所述的转化体在筛选microrna-126-5p抑制药物中的应用。
与现有技术相比，本发明提供的一种microrna-126-5p的靶基因结合序列，具有以下有益效果：
本发明提供的一种microrna-126-5p的靶基因结合序列、重组载体、转化体，所述靶基因结合序列能够与hspb8mrna3’utr基因的第786-793位核苷酸序列相结合，大量研究表明hspb8是一个心肌保护蛋白，microrna-126-5p的靶基因结合序列与hspb8mrna3’utr基因结合后，通过本发明的重组载体和转化体所包含的hspb8mrna3’utr基因调节hspb8的表达量，可显著抑制心肌缺血、缺血再灌注所致的损伤，有助于今后开发筛选microrna-126-5p抑制药物，为今后开发其抑制剂药物提供高效、大通量的筛选和评估平台和手段，将大大促进microrna-126-5p在心血管疾病的预防、诊断及治疗等中的应用。
附图说明
图1为重组pgl3-hspb8-3’utr载体的酶切鉴定图谱；
其中，m泳道为dnamaker，1号泳道为kpni单酶切，2号泳道为xhoi、bamhi双酶切；
图2为重组pgl3-hspb8-3’utr-mut载体的酶切鉴定图谱；
其中，m泳道为dnamaker，1号泳道为xhoi、bamhi双酶切；
图3为共转染mir-126-5p模拟物(mimics)的荧光素酶活性检测结果；
图4为共转染mir-126-5p抑制物(inhibitor)的荧光素酶活性检测结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明提供的一种microrna-126-5p的靶基因结合序列，所述靶基因结合序列的核苷酸序列如seqidno.1所示，并且所述靶基因结合序列位于hspb8mrna3’utr基因的第786-793位，其中所述hspb8mrna3’utr基因的核苷酸序列如seqidno.2所示。其中microrna-126-5p的核苷酸序列为3`-gcgcaugguuuucauuauuac-5`。
为了验证microrna-126-5p基因的靶基因结合序列的结合作用，我们构建了包含该结合序列的重组pgl3-hspb8-3’utr载体和缺失该结合序列的重组pgl3-hspb8-3’utr-mut载体，并利用荧光素酶报告基因系统观察了该结合序列对hspb8mrna的3’utr的调控作用，具体步骤如下：
1、重组pgl3-hspb8-3’utr载体的构建
1.1、以大鼠基因组dna为模板，采用带有xbai、bamhi酶切位点的引物、pfu高保真酶进行pcr，扩增出814bp的片段后，将814bp的片段凝胶回收。
其中，引物为正向引物：5’-gctctagagacgtcagccttggtccttc-3’；
反向引物：5’-cgggatccatgaacattattatttactc-3’；
正向引物和反向引物序列中的下划线为酶切位点序列。
pcr体系如下：
其中，pfu高保真酶按说明操作，稀释成5μ/μl，通过计算，将引物均稀释成12.5μmol/l浓度使用。
pcr程序如下：
94℃预变性2分钟，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸55s，40个循环，72℃延伸10分钟，4℃保存产物。
1.2、将814bp的片段经xbai、bamhi双酶切，凝胶回收目的基因片段；将pgl3-lucpromoter载体(clontech公司)经xbai、bamhi双酶切，凝胶回收长序列的载体片段，将目的基因片段和载体片段经t4连接酶连接过夜(连接时间≥12h)，然后凝胶回收连接产物，即得到重组pgl3-hspb8-3’utr载体，将重组pgl3-hspb8-3’utr载体进行细菌转化，挑选单克隆，进行kpni单酶切，xhoi、bamhi双酶切鉴定及测序，重组pgl3-hspb8-3’utr载体的酶切鉴定图谱如图1所示，证实重组pgl3-hspb8-3’utr载体构建成功。
所述重组pgl3-hspb8-3’utr载体中含有萤火虫荧光素酶或海洋腔肠荧光素酶报告基因。
2、重组pgl3-hspb8-3’utr-mut载体的构建
人工合成如seqidno.3所示，该序列是将hspb8mrna3’utr序列(如seqidno.2所示)中第786-793位的靶基因结合序列(如seqidno.1所示)突变为gctgctgc得到的。
2.1、以pgl3-hspb8-3’utr载体为模板，采用带有xbai、bamhi酶切位点的引物进行pcr，扩增出814bp的基因片段后，将814bp的基因片段凝胶回收。
其中，引物包括
正向引物：
5’-gctctagagacgtcagccttggtccttc-3’；
反向引物：
5’-cgggatccatgaagctgctgctttactcttatcttcccccta-3’；
正向引物和反向引物序列中的下划线为酶切位点序列。
pcr体系和pcr程序与“步骤1.1”所述的pcr体系和pcr程序相同，区别仅在于，将使用的引物替换为正向引物：5’-gctctagagacgtcagccttggtccttc-3’；和反向引物：5’-cgggatccatgaagctgctgctttactcttatcttcccccta-3’。
2.2、将814bp的基因片段经xbai、bamhi双酶切，凝胶回收mut目的基因片段；将pgl3-lucpromoter载体(clontech公司)经xbai、bamhi双酶切，凝胶回收长序列的载体片段，将mut目的基因片段和载体片段经t4连接酶连接过夜(连接时间≥12h)，然后凝胶回收连接产物，即得到重组pgl3-hspb8-3’utr-mut载体，将重组pgl3-hspb8-3’utr-mut载体进行细菌转化，挑选单克隆，进行xhoi、bamhi双酶切鉴定及测序，重组pgl3-hspb8-3’utr-mut载体的酶切鉴定图谱如图2所示，证实重组pgl3-hspb8-3’utr-mut载体构建成功。
3、荧光素酶报告基因系统检测
将大鼠心肌细胞接种于24孔板，细胞贴壁生长3-5天。分别将500ng构建的报告基因载体(重组pgl3-hspb8-3’utr载体、重组pgl3-hspb8-3’utr-mut载体、空pgl3-lucpromoter载体)与100ng校正载体prl-tk共转染接种在24孔板的心肌细胞中，分为重组pgl3-hspb8-3’utr载体组、重组pgl3-hspb8-3’utr-mut载体组和载体对照组；
我们将mir-126-5p模拟物(mimics)分别加入重组pgl3-hspb8-3’utr载体组、重组pgl3-hspb8-3’utr-mut载体组和载体对照组中，研究对mir-126-5p模拟物(mimics)的作用；将mir-126-5p抑制物(inhibitor)分别加入重组pgl3-hspb8-3’utr载体组、重组pgl3-hspb8-3’utr-mut载体组和载体对照组中，研究对mir-126-5p抑制物(inhibitor)的作用；然后以添加等同质量超纯水的样品为ctrl组。加入mir-126-5p模拟物(mimics)、mir-126-5p抑制物(inhibitor)或者超纯水共转染24h后，去培养基，用pbs缓冲液洗三次，每孔加入100μl的plb细胞裂解液，室温摇荡20min后收集细胞裂解物。采用promega公司的双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测萤火虫荧光素酶活性。即将30μl细胞裂解液与100μl的荧光素酶检测试剂ii(larii)均匀混合，立即用荧光发光计测量萤火虫荧光素酶的活性；然后，在荧光发光计试管中加入100μl的stop&glotm试剂，以淬灭萤火虫荧光素酶反应，同时激活海肾荧光素酶反应，并立即测量海肾荧光素酶的活性，计算两荧光素酶活性比值，得到相对荧光素酶活性活性。
采用荧光素酶报告基因系统观察了microrna-126-5p基因对hspb8mrna的3’utr的调控作用。结果如图3和图4所示，图3为共转染mir-126-5p模拟物(mimics)的荧光素酶活性检测结果，图4为共转染mir-126-5p抑制物(inhibitor)的荧光素酶活性检测结果。
结果显示，与ctrl组相比，共转染mir-126-5p模拟物(mimics)+pgl3-hspb8-3`utr组的荧光素酶的活性明显下降，共转染mir-126-5p抑制物(inhibitor)+pgl3-hspb8-3`utr组的荧光素酶的活性明显升高；说明缺失了microrna-126-5p基因的靶基因结合序列，则microrna-126-5p基因的调控作用相应的消失。表明，microrna-126-5p基因能够与大鼠hspb8mrna3’utr基因通过microrna-126-5p基因的靶基因结合序列(如seqidno.1所示)相结合，从而对hspb8起调控作用。利用重组pgl3-hspb8-3’utr载体制备而成的生物转化体中含有大量的microrna-126-5p的靶基因结合序列，其能够与microrna-126-5p基因相结合，对今后开发microrna-126-5p抑制药物具有非常重要的临床意义，将大大促进microrna-126-5p在心血管疾病的预防、诊断及治疗等中的应用。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
序列表
<110>中南大学
<120>一种microrna-126-5p的靶基因结合序列、重组载体、转化体及应用
<160>3
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>8
<212>dna
<213>人工序列
<400>1
taataatg8
<210>2
<211>844
<212>dna
<213>人工序列
<400>2
gacgtcagccttggtccttctttgctccaggcccctgccccagggactctctgatttgag60
ggtagacgactttagcagcactcagatttaaggcaactcagatgttgggggatgggaggg120
agaaccaaatgaccatccctggataatgtagtagtagatttctccacagggtgacacaat180
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<400>3
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