本发明涉及哺乳动物细胞合成生物学与疾病基因或细胞治疗技术领域，集传统药物治疗和基于合成生物学的细胞治疗的联合，具体涉及一种基因环路诱导表达调控系统及调控方法和在治疗肝病合并糖尿病中的应用。
背景技术：
合成生物学旨在以工程学思想作为指导，对生物分子系统进行遗传学改造、对生命过程或生物体进行有目标的设计、改造、乃至重新合成，使细胞和生物体具备某些特定新功能的新兴学科。利用合成生物学的方法和理论可以创造针对生物医药、环境能源、生物材料等问题的新“生命体系”。经过近十年的飞速发展，合成生物学从起步到现在，已经在多个应用领域取得重大进展。尤其是在哺乳动物细胞合成生物学领域，人们设计、构建了多种可控的基因遗传电路用于诊断、治疗代谢疾病、癌症、免疫等相关疾病。
糖尿病是当前威胁全球人类健康的最重要的慢性流行性疾病之一。全球糖尿病患者超过3.6亿。仅我国糖尿病患者已超过1亿，成为全球糖尿病患者最多的国家。相关调查资料显示，糖尿病并发症是糖尿病对机体的危害最重要的原因之一，其中糖尿病与肝脏疾病的并发概率非常高，比如糖尿病酮症酸中毒时肝损害程度会明显加重。还有相关文献报道，肝损伤也会引起血糖升高等糖尿病症状，慢性丙型肝炎患者的糖尿病并发率为21％～50％。一般糖尿病会引起肝组织结构损伤，而肝损伤会严重影响糖代谢而导致糖尿病，因此两者之间形成恶性循环。临床研究显示，8.4％的2型糖尿病及2.1％的i型糖尿病患者为hcv阳性，50％～80％的慢性肝病患者存在糖耐量异常的情况。目前，传统的糖尿病和肝病治疗方式依赖于改变生活方式以及一些传统的药物治疗，而这些治疗方案对大多数病人并无显著疗效。甚至一些治疗糖尿病的化学药物会一定程度改变代谢途径导致肝毒性或肝损伤，并不能让肝损伤等并发症得到有效改善，所以说糖尿病的治疗往往顾此失彼。同时新型药物的研发大多都有成本高，周期长的问题，即使能上市，其价格也很昂贵。
齐墩果酸(oa)是一种三萜类小分子，它广泛地分布于几乎整个植物界。oa和它的衍生物具有众多潜在的药理学活性，如保肝效应和抗炎、抗氧化、抗癌活性。而且oa已经成为当下有效治疗肝损伤等疾病的上市非处方类保肝药物，价格便宜，可谓物美价廉。但是当前还没有关于oa可以用于调控胰岛素或胰高血糖素样肽并且治疗糖尿病的报道。
技术实现要素：
本发明利用合成生物学设计理念，公开了一种基因环路诱导表达调控系统(例如，以齐墩果酸和强力霉素(doxycycline)共同调控)，可以实现同时治疗一种或多种疾病(例如，糖尿病和/或肝脏疾病)的目的。
本发明提出了一种基因环路诱导表达调控方法，所述方法由基因环路诱导表达系统调控，所述基因环路诱导表达系统包括信号感受装置、信号处理装置、信号报告效应装置；当所述信号感受装置感知外界信号，所述信号感受装置被激活，通过所述信号处理装置将所述外界信号转化为细胞内部信号，并激活细胞内信号通路，磷酸化所述信号处理装置中的转录激活因子，从而激活所述信号报告效应装置中的启动子表达目的基因。
所述方法进一步包括：利用启动装置提供用于被所述信号感受装置识别的外界信号。
所述方法进一步包括：利用关闭装置解除所述信号报告效应装置中的重组转录因子与其特异识别的操纵子之间的结合，从而终止目的基因的表达。
其中，所述启动装置含有能识别所述信号感受装置的小分子化合物。优选地，所述启动装置含有的小分子化合物包括齐墩果酸、熊果酸、或胆汁酸衍生物。
其中，所述信号感受装置含有能识别所述启动装置的小分子化合物的受体，所述受体能使细胞感知外界信号，并激活细胞内信号通路。优选地，所述信号感受装置含有的受体包括齐墩果酸受体、熊果酸受体、或胆汁酸受体gpbar1。
其中，所述信号处理装置含有转录激活因子。优选地，所述信号处理装置的含有的转录激活因子包括tetr、pmer、vanr、cabr或ttgr。
其中，所述信号报告效应装置含有单一报告或含有两种报告，所述单一报告是用于检测报告系统基因表达或蛋白表达，所述两种报告是用于同时检测报告系统基因表达和蛋白表达。优选地，所述信号报告效应装置用于检测报告系统seap、egfp、胰岛素、glp-1其中任意一种表达，或用于同时检测报告系统基因表达和蛋白表达，包括seap-2a-insulin、seap-2a-glp-1、egfp-2a-glp-1。
其中，所述关闭装置含有能解除信号处理装置含有的转录激活因子与启动子之间结合的小分子化合物。
其中，优选地，所述关闭装置含有的能解除信号处理装置含有的转录激活因子与启动子之间的结合的小分子化合物，包括强力霉素、对羟基苯甲酸、香草酸、苯甲酸或皮根素。
本发明首先提出了一种基因环路诱导表达调控系统，所述系统包括信号感受装置、信号处理装置、信号报告效应装置。
其中，所述信号感受装置含有能识别所述启动装置的小分子化合物的受体，所述受体能使细胞感知外界信号，并激活细胞内信号通路。所述信号感受装置可以是一种胆汁酸受体gpbar1(g蛋白偶联受体)，该受体可以是哺乳动物来源的，例如人源或鼠源的，该受体可以被齐墩果酸(oa)、熊果酸(ua)或者其它胆汁酸衍生物小分子激活，该受体可激活细胞内下游camp-pka信号通路。所述外界信号包括所述信号感受装置能感知识别的外界信号分子如齐墩果酸(oa)、熊果酸(ua)或其它胆汁酸衍生物等。
优选地，所述信号感受装置是人源的胆汁酸感受器(gpbar1)。优选地，所述胆汁酸受体gpbar1的表达可以通过不同活性的启动子来表达，主要包括phcmv、psv40、pteto7、puc57、phcre、phcre-tight、pnf-κb、pnfat、pare。其用于能使细胞感知外界信号分子如齐墩果酸(oa)、熊果酸(ua)等。
其中，所述信号处理装置能使细胞将其感知到的所述外界信号转化为细胞内部信号。所述信号处理装置可以是一种人工合成的转录激活因子tetr-creb1，该处理器中的tetr蛋白可被其它多种能与特定dna序列结合的蛋白所替代，例如pmer、vanr、cabr、ttgr等。而creb1蛋白则不变，可以是人源或其它哺乳动物来源的creb1全长或核心序列。tetr与creb1之间可以由连接肽融合，连接肽长度从0-30个氨基酸不等。同时tetr与creb1之间前后位置可以互换，即tetr可以连接到creb1的c端，也可以连接到n端，并且都有活性。所述信号处理装置可在细胞中合成tetr-creb1重组转录因子蛋白，其用于能使细胞将外界刺激信号转化为细胞内部信号，及激活细胞内camp信号通路。
所述信号报告效应装置含有单一报告或含有两种报告，所述单一报告是用于检测报告系统基因表达或蛋白表达；所述两种报告是用于同时检测报告系统基因表达和蛋白表达。
其中，所述信号报告效应装置能使细胞在所述信号感受装置和所述信号处理装置的协同下，将外界信号以报告基因表达的方式体现出来。所述信号报告效应装置可以是一种人工合成的启动子与报告基因系统(phcmvmin*-reporter)、(phcmvmin*＝teto7-phcmvmin)等，能使细胞在感受和处理装置的协同下，将外界信号以报告基因表达的方式体现出来(例如：seap、egfp等)，也可用于表达药物蛋白胰岛素、glp-1、脂联素等用于疾病治疗。报告基因可以是seap、gfp以及具有疾病治疗效果的功能蛋白glp-1、胰岛素、脂联素等。
本发明还提出一种基因环路诱导表达调控系统，其进一步包括启动装置。所述基因环路诱导表达调控系统包括启动装置、所述信号感受装置、所述信号处理装置、所述信号报告效应装置。其中，所述启动装置提供或含有外界信号，能识别所述信号感受装置。
其中，所述启动装置含有外界信号即能识别所述信号感受装置的小分子化合物。优选地，所述外界信号即能识别所述信号感受装置的小分子化合物包括齐墩果酸(oa)或熊果酸(ua)或者其它胆汁酸衍生物小分子。所述信号感受装置能被小分子化合物包括齐墩果酸(oa)、熊果酸(ua)或者其它胆汁酸衍生物小分子激活。
本发明还提出一种基因环路诱导表达调控系统，其进一步包括关闭装置。所述基因环路诱导表达调控系统包括所述启动装置、所述信号感受装置、所述信号处理装置、所述信号报告效应装置、所述关闭装置。其中，所述关闭装置用于解除所述信号报告效应装置中重组转录因子与其特异识别的操纵子之间的结合，如tetr与启动子之间的结合。
在一具体实施方案中，所述能解除tetr与phcmvmin*启动子之间的结合的小分子化合物是强力霉素(doxcycline)等。在另一具体实施方案中，所述信号处理装置tetr-creb1的tetr蛋白可以被pmer、vanr、cabr、ttgr等替代，相应地，关闭装置可以被能分别解离pmer、vanr、cabr、ttgr与他们相对应的dna结合序列的小分子化合物所关闭，即所述关闭装置含有能分别解离pmer-creb1、vanr-creb1、cabr-creb1、ttgr-creb1与其相对应的dna结合序列(opmer、ovanr、ocabr、ottgr)的小分子化合物，例如：对羟基苯甲酸、香草酸、苯甲酸、皮根素等。
本发明基因环路诱导表达调控系统(基因开关)中，所述信号感受装置、所述信号处理装置、所述信号报告效应装置，分别由人工设计、合成的三个质粒系统装载并同时与细胞内源信号通路偶联后执行生物功能。本发明所述基因环路诱导表达调控系统如图1所示，所述系统中涉及的序列详见附表。
本发明中，所述启动装置可以是通过齐墩果酸(oa)、熊果酸(ua)、胆汁酸及其衍生物等打开基因环路系统进行基因调控表达。其都有相似的分子结构，可以作为配体从而活化gpbar1，然后激活细胞下游camp信号通路。camp信号通路可进一步活化creb1，从而起始转录，表达报告基因。其中活化的creb1可以有以下几种形式存在：tetr-creb1、pmer-creb1、vanr-creb1、cabr-creb1、ttgr-creb1等。本发明也可以通过齐墩果酸(oa)、熊果酸(ua)、胆汁酸及其衍生物等调控报告基因的精确表达。
在一个具体实施方案中，oa作用于胆汁酸受体gpbar1(一种g蛋白偶联受体)激活下游camp-pka信号通路，并通过磷酸化合成的转录激活因子tetr-creb1的creb1活性位点，从而激活其靶标启动子phcmvmin*表达目的基因。
在另一具体实施方案中，通过oa来精准调控降血糖药物胰岛素和glp-1表达从而实现治疗一型或二型糖尿病的目的。同时结合其自身修复肝损伤的作用，最终实现协同治疗肝病合并糖尿病的目的。
本发明中，所述信号感受装置含有胆汁酸受体gpbar1，可以选自以下：
pxs16(mcs-gpbar1-pa)、pxs20(pnfat-gpbar1-pa)、pxs21(pare-gpbar1-pa)、pxs22(pcre-gpbar1-pa)、pxs23(pcre-tight-gpbar1-pa)、pxs24(phcmv*-1-gpbar1-pa)、pxs26(psv40-gpbar1-pa)、pxs25(phcmv-gpbar1-pa)、pxs43(pnfkb-gpbar1-pa)。
在细胞内表达gpbar1，用来识别特殊小分子(例如，齐墩果酸(oa)、熊果酸(ua)等)的存在与否，并感应其剂量大小。所述信号感受装置pxs22(pcre-gpbar1-pa)特点之一是相对低剂量表达gpbar1，受oa的激活，引起camp信号通路的活化，并且活化程度在一定范围内与oa的剂量呈正相关关系，同时自身可以被自身的信号通路所激活放大，产生自我放大效果。本发明中，也可采用pxs25(pcmv-gpbar1-pa)作为信号感受装置质粒，避免在特殊细胞中各种信号通路的交叉干扰。
本发明中，所述信号处理装置含有转录激活因子，可以选自以下：
pxs13(pcmv-tetr-creb1-pa)、psv40-tetr-creb1-pa、pcmv-pmer-creb1-pa、pcmv-cabr-creb1-pa、pcmv-vanr-creb1-pa、pttgr-tetr-creb1-pa等。
在细胞中高表达融合蛋白tetr-creb1，融合蛋白的两部分序列分别是它们全蛋白序列的一部分，tetr作为反式作用元件用来识别并结合在其特定的dna顺式作用元件teto7，将后半部分融合蛋白creb1拉近到转录起始位点，当感受装置被oa激活之后，引起的camp信号通路活化creb1，从而起始转录。此外，tetr在doxcycline存在时，可与其顺式作用元件脱离，并携带creb1远离转录起始位点，这样即使creb1被磷酸化激活，也不能起始转录，从而实现基因环路诱导表达调控系统(基因开关)的关闭。
本发明中，当改变信号处理装置中的tetr蛋白时，报告系统中的启动子phcmvmin*则需相应改变。启动子中tetr的dna结合区域则需相应替换成pmer、vanr、cabr、ttgr等蛋白的dna结合序列，而其下游的最小启动子序列hcmvmin部分可不做改动。tetr蛋白可被其它多种能与特定dna序列结合的蛋白所替代，例如pmer、vanr、cabr、ttgr等。而creb1蛋白则不变，可以是人源或啮齿动物来源的creb1全长或核心序列。
本发明中，所述信号处理装置(如，tetr-hcreb1)中，tetr-hcreb1分别是它们全蛋白序列的一部分融合而成。tetr与hcreb1可通过接头肽相连。
本发明中，所述信号报告效应装置为含有单一报告，用于单一的报告系统基因表达检测，包括seap、egfp，或仅表达单一蛋白药物用于疾病治疗，包括胰岛素、glp-1；或所述信号报告效应装置为含有两种报告，用于同时检测报告系统基因表达和表达用于疾病治疗的蛋白药物，包括seap-2a-insulin、seap-2a-glp-1、egfp-2a-glp-1等。
即，所述信号报告效应装置主要分为两种，其一含有单一报告基因，用于单一的报告系统基因表达检测(如：seap、egfp等报告基因)或仅表达单一蛋白药物用于疾病治疗(如：胰岛素、glp-1等降血糖蛋白)；其二含有两种报告基因，用于同时检测报告系统基因表达和表达用于疾病治疗的蛋白药物(如：seap-2a-insulin、seap-2a-glp-1、egfp-2a-glp-1等)；所述信号报告效应装置可以选自以下：
pmf111强力霉素相应的seap报告基因表达载体(phcmv*-1-seap-pa)；
phy79phcmv*-1启动子驱动的egfp报告基因表达载体(phcmv*-1-egfp-pa)；
phy73phcmv*-1启动子驱动的glp-1报告基因表达载体(phcmv*-1-glp-1-fc-pa)；由于天然的glp-1活性区域在其n端，并且在体内极易降解，半衰期只有2-5分钟。本发明中用phy73(phcmv*-1-glp-1-fc-pa)作为信号报告效应装置，通过在glp-1的c端偶联fc片段，既不影响其活性，又明显提高其在体内的稳定性，同时还可以通过检测fc来定量glp-1。
pxs36(pteto7-seap-2a-insulin-pa)；直接调控表达胰岛素难度较大，而且不容易定量检测。
本发明还提出了一种含有两种或多种报告基因的信号报告效应装置。本发明首次提出利用两种报告基因见实施例20-25，通过2a系统使seap与胰岛素(insulin)同时并等量或正相关量表达，前者可以在体外实验中间接定量后者，同时后者在体内实验中发挥作用不受前者影响，二者在体内共同受齐墩果酸(oa)调控表达。本发明有效解决了胰岛素表达难和定量难的问题。
本发明中，所述信号报告效应装置(如，phcmvmin*-reporter)中，phcmvmin*为tetr蛋白特异结合的最小启动子。phcmvmin*最小启动子可驱动表达任何蛋白基因，例如碱性磷酸酶seap、绿色荧光蛋白egfp、胰岛素、人胰高血糖素样肽(glp-1)等。将需要表达的多种功能多肽或蛋白，可以通过2a序列在同一个表达载体上同时表达，例如seap-2a-insulin、gfp-2a-insulin等，这样不仅解决了启动子直接表达insulin表达量低的问题，同时也解决了insulin定量检测的问题。
本发明中，所述关闭装置可通过加入强力霉素(doxycycline，dox)来实现基因开关的关闭。强力霉素(doxcycline)可强制解离tetr与phcmvmin*启动子之间的相互结合。因此，可通过添加强力霉素关闭基因表达，从而实现安全阀的目的。所述强力霉素可以与tetr竞争性结合，使tetr不能与其特异性dna序列结合，从而关闭下游基因的转录表达。同时dox在体内半衰期相对较长，而且与tetr的结合性强，高效而快速。具体实施方案中，用dox作为关闭装置，可以做到更安全，更可靠。另一具体实施方案中，所述关闭装置可以用对羟基苯甲酸、香草酸、苯甲酸、皮根素等小分子化合物代替dox，解离pmer-creb1、vanr-creb1、cabr-creb1、ttgr-creb1与其相对应dna结合序列，从而来关闭所述基因环路诱导表达调控系统，相对应地，所述信号信号处理装置为pmer-creb1、vanr-creb1、cabr-creb1、ttgr-creb1等。
本发明还提出一种细胞，其含有所述基因环路诱导表达调控系统。所述细胞可以是各种哺乳动物细胞，包括hek-293、hek-293t、hmsc、hana3a等细胞系。
本发明中，所述细胞包括以下实施例中涉及到的细胞系有hela，cho-k1，hek-293t，hana3a，hmsc-tert等，分别共转由pxs25、pxs13和报告(如，pmf111)三质粒组成的完整系统，通过合适的比例优化，得到具有良好调控性能的配方，例如，在hek-293t细胞系中三种质粒的质量配比是1:20:20。考虑到不同的细胞系对不同的启动子有偏好，优选地，本发明具体实施方案在hek-293t细胞系中进行，其优点包括：该细胞系在本发明微胶囊中有极好的生存状态，例如，其对比与hmsc-tert细胞系，极易存活；可以利用其表达多种有功能的效应蛋白或多肽，例如seap、insulin、glp-1等。
本发明还提出一种包裹细胞的微胶囊，其含有所述基因环路诱导表达调控系统或含有所述细胞。所述微胶囊中包裹的细胞中含有所述基因环路诱导表达调控系统。
本发明中，采用海藻酸-多聚赖氨酸-海藻酸(alginate-polylysine-alginate-membrane)微胶囊包裹系统，采用现有的细胞包装方法，对转载有质粒pxs25、pxs13、pmf111的hek-293t、hmsc-tert等细胞进行包裹，然后进行体内腹腔或皮下移植。本发明根据实际情况对反应条件进行优化，进而得出最适合的微胶囊，包括微胶囊的大小、微胶囊膜的厚度、以及微胶囊膜分子筛孔径大小等等，详见实施例15，其中微胶囊的制定参数包括：喷头装配(200μm)，注射速度(20ml/min)，超声震动断流(1300hz)的和静电分散(1100v)等。
本发明微胶囊具有以下特征：所述微胶囊是一种半透膜，该半透膜能让55kd以下的蛋白分子自由通透，而大于75kd的大蛋白不能自由通透。且，所述微胶囊内的细胞生长代谢所需营养物质均可透过半透膜自由交换。所述微胶囊保证启动系统的小分子化合物oa、ua等可以顺利通过微胶囊半透膜，并激活细胞。所述微胶囊保证产生的效应分子(包括各种可分泌的蛋白seap、insulin、glp-1等)可以分泌到微胶囊外，从而释放到血液中并产生功能。所述微胶囊保证被包裹的工程化细胞在体内不被宿主的免疫系统所攻击；所述微胶囊保证整套系统在体内稳定保持相当长的时间。所述微胶囊系统可以保护宿主对含有基因环路系统细胞的免疫攻击，且微胶囊内细胞释放的基因表达产物可以自由释放到体外进入血液循环系统。
本发明中，所述调控系统可以被上载到不同哺乳动物细胞中(例如hek-293、hmsc、hana3a等)，通过微胶囊包裹技术，将微胶囊移植到肝病合并糖尿病模型小鼠体内，当通过注射或口服给予小鼠oa时，达到协同治疗肝病和糖尿病的目的。
本发明首次提出了一种基因环路诱导表达调控方法，当信号感受装置感知外界信号，所述信号感受装置被激活，通过所述信号处理装置将所述外界信号转化为细胞内部信号，并激活细胞内信号通路，磷酸化所述信号处理装置中的转录激活因子，从而激活所述信号报告效应装置中的启动子表达目的基因。
进一步地，本发明基因环路诱导表达调控方法包括：利用启动装置提供用于被所述信号感受装置识别的外界信号。所述系统中的各装置(包括启动装置、信号感受装置、信号处理装置、信号效应报告装置等)协同有序配合行使功能，实现目的基因的表达。
在具体实施方案中，所述启动装置中的外界信号(例如，齐墩果酸(oa)等)刺激作用于所述信号感受装置中的受体(例如，胆汁酸受体gpbar1等)，胆汁酸受体gpbar1)被齐墩果酸(oa)激活，从而激活细胞内下游camp-pka信号通路，进一步磷酸化所述处理器中的转录激活因子(例如，tetr-creb1)的creb1活性位点，从而激活所述信号效应报告装置中的启动子(例如，phcmvmin*)表达目的基因。
本发明首次提出在细胞中转入本发明所述整套调控系统装置。本发明利用常用保肝类药物oa、ua等，同时将其作为配体识别并活化胆汁酸受体gpbar1，配体与其结合之后可激活下游camp-pka信号通路，且该信号通路中的成分是细胞自身所有，不需要额外加入。所述信号处理装置中的转录激活因子tetr-creb1在感知camp-pka信号后被磷酸化激活，从而激活报告器中的启动子phcmvmin*，表达目的基因。
进一步地，本发明基因环路诱导表达调控方法包括：利用关闭装置解除所述信号报告效应装置中的重组转录因子与其特异识别的操纵子之间的结合，从而终止目的基因的表达。本发明方法中，调控所述系统中的各装置(包括启动装置、信号感受装置、信号处理装置、信号效应报告装置、关闭装置等)协同有序配合行使功能，不仅可以调控实现目的基因的表达，还可以调控终止目的基因的表达。
本发明方法中，所述信号感受装置(胆汁酸受体gpbar1)被所述启动装置中的齐墩果酸(oa)激活，从而激活下游camp-pka信号通路，进一步磷酸化所述信号处理装置中的转录激活因子tetr-creb1的creb1活性位点，激活报告器中的启动子phcmvmin*表达目的基因，实现目的基因的表达。进一步地，通过所述关闭装置解除tetr与phcmvmin*启动子之间的结合，从而终止所述启动子的表达。例如，在所述调控系统中加入强力霉素(dox)，使tetr与phcmvmin*启动子之间的结合被强制解离，从而终止所述启动子phcmvmin*表达目的基因。本发明中，终止信号是直接作用于转录因子，即使转录因子已经被激活，也不能激活下游基因表达。例如，强力霉素(doxycycline，dox)可以与tetr竞争性结合，使tetr不能与其特异性dna序列结合，从而关闭下游基因的转录表达。
本发明提出的基因环路诱导表达调控系统及调控方法，整个过程快速高效，例如，dox在体内的稳定性相对较高，与tetr的结合能力高，直接作用于激活区域，终止作用快速高效。本发明调控高效且适宜于广泛应用，例如，oa对gpbar1的激活效率可以跟其天然最适配体石胆酸相媲美，而oa在自然界的丰度却远远超过石胆酸，更易于人们得到利用。
本发明中，整个激活过程具有相对严格的计量效应，即，报告基因的表达严格反映了药物的添加剂量。例如，在一定浓度范围内，随着oa剂量的增加，报告基因seap的表达量显示明显的正相关效应。
本发明中，整个调控过程可逆转，例如，可以通过控制oa、dox的存在与否，对所述系统实现打开启动和/或关闭。而且，正常体内浓度的胆汁酸不会激活所述调控系统中的调控元件(装置)，只有施加特定的所述启动装置之后，所述调控系统才被激活。因此当含有该调控元件的微胶囊细胞移植到体内后，正常情况下不会被激活表达基因。
本发明中，在野生型小鼠中，将含有本发明调控系统的微胶囊细胞移植到小鼠腹腔后，当小鼠给予腹腔注射齐墩果酸和不同剂量dox后，可以实现在动物体内不同程度地关闭报告基因seap的表达。如，当小鼠给予腹腔注射或口服齐墩果酸后，可实现在动物体内调控报告基因seap的表达。如，所述关闭装置如同安全阀装置。当目的基因表达过多或想随时停止目的基因的表达时，则可以通过在所述系统中加入dox立即停止目的基因表达，从而使本发明应用更为安全可靠。
本发明可应用于一种或多种疾病的治疗。如，在肝病合并糖尿病模型鼠体内，含有该调控元件的微胶囊细胞移植到小鼠腹腔后，当小鼠给予口服齐墩果酸药片后，小鼠体内的微胶囊细胞被激活表达glp-1，从而能快速起到降血糖治疗糖尿病的效果，而齐墩果酸同时起到了肝脏保护功能，最终实现协同治疗肝病合并糖尿病的目的。本发明调控系统及方法可用于同时治疗不同类型的多种疾病。本发明通过表达不同治疗功能的目的基因蛋白即可实现治疗不同疾病。
本发明提出了所述基因环路诱导表达调控系统和/或所述细胞和/或所述微胶囊和/或所述齐墩果酸(oa)或熊果酸(ua)或其他胆汁酸及其衍生物等分别在制备调控胰岛素表达、调控glp-1表达的药物中的应用。
本发明中，所述调控系统中的所述信号报告效应装置(phcmvmin*-reporter)，phcmvmin*为tetr蛋白特异结合的最小启动子。phcmvmin*最小启动子可驱动表达胰岛素、人胰高血糖素样肽(glp-1)等具有疾病治疗价值的药物蛋白。将需要表达的多种功能多肽或蛋白，可以通过2a序列在同一个表达载体上同时表达，例如seap-2a-insulin、gfp-2a-insulin等，这样不仅解决了启动子直接表达insulin表达量低的问题，同时也解决了insulin定量检测的问题。
本发明还提出了所述基因环路诱导表达调控系统和/或所述细胞和/或所述微胶囊和/或所述齐墩果酸(oa)或熊果酸(ua)或其他胆汁酸及其衍生物等在同时治疗肝病和糖尿病的药物中的应用。
本发明所述调控系统可以被上载到不同哺乳动物细胞中(例如hek-293、hmsc、hana3a等)，通过微胶囊包裹技术，将微胶囊移植到肝病合并糖尿病模型小鼠体内，当通过注射或口服给予小鼠oa时，从而达到协同治疗肝病和糖尿病的目的。本发明策略是把小分子肝保护药物的功能进一步放大：oa自身既能起到治疗肝病保护肝脏的效果，同时能激发该基因环路系统表达glp-1从而治疗糖尿病的目的。本发明通过利用具有良好肝保护功能的oa或ua精准调控转基因表达，同时也可通过加入强力霉素来关闭转基因表达。本发明治疗方式是协同治疗肝源性糖尿病的新思路、新方法。
本发明有益效果包括：首次提出并成功设计合成了一种oa调控的转基因表达基因环路系统。本发明可以通过oa精准定量调控基因表达；可以通过dox关闭基因环路中的基因表达，而现有基因表达调控系统中均没有关闭装置功能；所使用基因表达调控开关激发分子oa是一种价格低廉极易获得的肝保护药，在临床广泛使用，而目前现有技术中的基因开关激发分子都是些抗生素或防腐剂等。本发明首次提出可通过oa来调控glp-1的表达，起到同时降血糖、缓和胰岛素抵抗、降血脂以及降低肝脏相关酶指标，达到协同治疗肝病合并糖尿病的目的。而目前传统的单一疗法只能单一针对其中症状之一进行治疗，往往会顾此失彼。本发明为多因素疾病治疗提供了新思路和新策略。
进一步地，针对现有技术在治疗肝病及糖尿病时存在顾此失彼的不足，本发明综合考究糖尿病的特点和当前的治疗方案，结合合成生物学中基因开关的设计思路，将糖尿病治疗和肝损伤治疗进行有机对接，进行协同治疗，基于药物和细胞治疗的联合疗法来实现同时治疗多因素的复杂疾病。本发明通过非处方类保肝药物齐墩果酸(oa)来调控以精准表达治疗糖尿病药物胰高血糖素样肽(glp-1)或胰岛素。利用oa等小分子对我们所设计的基因环路诱导表达降血糖蛋白药物和其自身保肝护肝的多种生理学活性，首次实现同时治疗糖尿病兼并肝损伤，从而达到一药治多病的治疗目的。且，本发明利用细胞微胶囊包裹技术，可以把含有该基因电路控制系统的工程化细胞移植到肝病合并糖尿病小鼠体内，当小鼠口服oa后，可以激活基因开关表达glp-1或胰岛素，从而达到治疗脂肪肝、急性肝损伤和糖尿病等诸多疾病的功效。本发明使用的激发分子oa为公认的肝保健药，通过合成生物学的方法，oa的生物学功能被进一步放大从而去调控降血糖蛋白药物的表达，最终实现一药治多病的协同治疗功效。该发明为肝病合并糖尿病的治疗提供了新方法和新策略，将有良好的临床应用前景。
附图说明
图1是本发明基因环路诱导表达调控系统及调控方法的原理示意图。
图2是验证oa激活gpbar1受体，从而激活camp信号通路。
图3是验证oa激活gpbar1行使camp信号通路的唯一性。
图4是oa特异性激活gpbar1。
图5是模拟健康野生型小鼠体内总胆汁酸的含量及浓度激活gpbar1与oa激活作用对比实验。
图6是在hek-293细胞中调控转基因表达的优化研究，利用不同启动子的gpbar1表达载体，对基因环路的优化。
图7是本发明的基因环路输出信号在不同细胞系中工作情况。
图8是本发明的基因环路输出信号在一定浓度范围条件下的对oa剂量依赖性，即oa标准品精准调控转基因表达。
图9是本发明的基因环路输出信号在对oa药片萃取物也有剂量依赖性，即oa药片萃取物精准调控转基因表达。
图10是oa精准调控报告基因egfp的表达。
图11是系统的可逆性检测。
图12是oa的不同刺激时间对基因环路输出的影响。
图13是dox关闭基因环路输出的剂量依赖性，即dox精准调控转基因表达。
图14是oa与dox同时调控基因环路输出。
图15是本发明基因环路工程化细胞的微胶囊制备。
图16是oa诱导微胶囊化细胞精准调控转基因表达。
图17是oa标准品在野生型小鼠体内诱导本发明基因环路，精准调控转基因表达。
图18是oa药片在野生型小鼠体内诱导本发明基因环路，精准调控转基因表达。
图19是dox关闭本发明基因环路在野生型小鼠中的精准调控转基因表达。
图20是oa诱导调控基因环路的胰岛素表达治疗i型糖尿病兼肝损伤疾病模型的治疗，显著降低总胆汁酸(t-bas)水平。
图21是oa诱导调控基因环路的胰岛素表达治疗i型糖尿病兼肝损伤疾病模型的治疗，显著降低ast水平。
图22是oa诱导调控基因环路的胰岛素表达治疗i型糖尿病兼肝损伤疾病模型的治疗，显著降低alt水平。
图23是oa诱导调控基因环路的胰岛素表达治疗i型糖尿病兼肝损伤疾病模型的治疗，糖耐受实验，表明系统可以有效改善高血糖症状。
图24是oa诱导调控基因环路的胰岛素表达治疗i型糖尿病兼肝损伤疾病模型的治疗，系统可以有效改善过度饮食症状。
图25是oa诱导调控基因环路的胰岛素表达治疗i型糖尿病兼肝损伤疾病模型的治疗，系统可以有效改善过度饮水症状。
图26是db/db小鼠的肝功能异常鉴定。
图27是在体外，验证本发明的基因环路经oa诱导调控表达glp-1。
图28是在野生型小鼠体内，验证本发明的基因环路经oa诱导调控表达glp-1。
图29是oa诱导调控基因环路的glp-1表达治疗ii型糖尿病兼肝功能异常疾病模型的治疗，显著降低ast水平。
图30是oa诱导调控基因环路的glp-1表达治疗ii型糖尿病兼肝功能异常疾病模型的治疗，显著降低alt水平。
图31是oa诱导调控基因环路的glp-1表达治疗ii型糖尿病兼肝功能异常疾病模型的治疗，显著降低ast/alt水平，改善肝功能异常。
图32是在db/db糖尿病兼肝功能异常的小鼠模型体内，验证本发明的基因环路经oa诱导调控表达glp-1。
图33是oa诱导调控基因环路的glp-1表达治疗ii型糖尿病兼肝功能异常疾病模型的治疗，糖耐受实验。
图34是oa诱导调控基因环路的glp-1表达治疗ii型糖尿病兼肝功能异常疾病模型的治疗，胰岛素耐受实验。
图35是oa诱导调控基因环路的glp-1表达治疗ii型糖尿病兼肝功能异常疾病模型的治疗，胰岛素耐受指数计算。
图36是齐墩果酸的异构体熊果酸(ua)，同样也可以激活齐墩果酸基因环路控制系统，并调控报告基因的精确表达。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1，基因环路诱导表达调控系统(基因开关)的构建
本发明基因环路诱导表达调控系统及调控方法，如图1所示。主要质粒的构建以及来源见表1。具体地，所述系统包括：启动装置(齐墩果酸(oa)或熊果酸(ua))、信号感受装置(gpbar1)、信号处理装置(tetr-hcreb1)、信号报告效应装置(phcmvmin*-reporter)、关闭装置(dox)。
本发明基因环路诱导表达调控系统(基因开关)可以实现在体内和体外的有效实施及调控，具体如下：
(一)体外实验方案，具体步骤如下：
第一步，种细胞。将收集好的细胞，以每孔3x104-5x104个细胞，种在24孔板中，加500μl/well含10％fbs的dmem培养基。
第二步，转染。在种细胞后的12到24h内进行转染(确保细胞贴壁，生长状况良好)，在保证质粒总量0.3μg/well的情况下，将质粒以最优质量配比与pei转染试剂(质粒与pei质量比1:3)加无血清的dmem混匀，总体积50μl/well，室温静置15min后滴加到培养板中。
第三步，加药，转染6h后换液，加入500μl/well含有10％fbs的dmem培养基，培养基中事先混合了一定浓度的oa。
第四步，选24h，48h，72h三个时间点检测报告基因(如seap，insulin，glp-1等)的表达情况。
第五步，利用数学分析软件进行统计学分析。
(二)体内实验方案，具体步骤如下：
第一步，模型鼠的建立。例如，糖尿病合并肝损伤模型。
第二步，种细胞。将收集好的细胞，以每孔3x106-5x106个细胞，种在15cmdish中，加25ml/dish含10％fbs的dmem培养基。
第三步，转染,在种细胞。12到24h内进行转染(确保细胞贴壁，生长状况良好)，在保证质粒总量30μg/dish的情况下，将质粒以最优配比与pei转染试剂(质粒与pei质量比1:3)加无血清的dmem混匀，总体积2.5ml/dish，室温静置15min后滴加到培养皿中
第四步，收集细胞，转染6h后换液，加入20ml/dish含有10％fbs的dmem培养基，孵育6h，胰酶消化，离心收集细胞。
第五步，微胶囊制备。
利用微胶囊制备仪inotechencapsulatorresearchunitie-50r(buchilabortechnikag,flawil,switzerland)和海藻酸-聚赖氨酸-海藻酸(alginate-polylysine-alginate-membrane)微胶囊包裹系统，主要参照limf.和suna.m，1980发表在《科学》杂志(第210期：页码：908-910)上的“microencapsulatedisletsasbioartificialpancreas”。
成功对转载有基因开关的工程细胞进行微胶囊化。其中，微胶囊形成的重要参数如下：装配200μm喷头，以20-40ml/min注射速度，加以1000-1300hz的超声震动断流和900-1100v的静电分散，可以形成微胶囊400-500units/s，微囊大小250-350μm；200-250cells/capsule。
第六步，小鼠体内微胶囊移植
将制备好的微胶囊利用10mmmops((n-吗啉)-丙烷磺酸)，0.85％nacl，在25℃时，ph＝7.2缓冲液，或者无血清培养基，或者pbs重悬至每1ml约含5x104个微囊，然后按照2x106capsules/kg小鼠体重腹腔注射，注意每次注射都要混匀，确保每只小鼠携带有的微胶囊数量是均衡的，从而保证实验准确性。
第七步，给药，药物调控
给药方式采用灌胃或者腹腔注射，标准品或者oa药片研磨粉，标准品事先需要用dmso溶解，再利用生理盐水重悬制得的均一悬液给小鼠灌胃，剂量为0-100mg/kg/d，每天给药两次，对照组以同样方式给予相同的溶剂。基因环路关闭系统的调控给药方式是腹腔注射强力霉素(doxycycline)(20μl,0–20mg/kg/d)。
实施例2，验证oa激活gpbar1受体，从而激活camp信号通路
第一步，种细胞。将收集好的hek-293t细胞，以每孔5x104个细胞，种在24孔板中，
加500μl/well含10％fbs的dmem培养基。
第二步，转染。在种细胞后12到24h内进行转染(确保细胞贴壁，生长状况良好)，在保证质粒总量0.3μg/well的情况下，将质粒pxs25(pcmv-gpbar1-pa)、pxs13(pcmv-tetr-linker-hcreb1-pa)、pmf111(pteto7-seap-pa)以最优配比(1:20:20)与pei转染试剂(质粒与pei质量比1:3)加无血清的dmem混匀，总体积50μl/well，室温静置15min后均匀滴加到培养板中。
第三步，加药。转染6h后换液，加入500μl/well含有10％fbs的dmem培养基，继续培养48h，分别更换事先已经配制的不同浓度梯度的oa(含有10％fbs的dmem)刺激30min后消化裂解细胞利用campassayelisa试剂盒(r&dsynstems,inc.,minneapolis,mn,usa,cat.no.skge002b,lot.no.316451)，检测camp的含量。实验数据详见图2。
本实施例结果表明oa确实激活gpbar1受体，并且确实激活camp信号通路，同时表现出良好的oa剂量性效应，说明本发明的环路设计是正确的。
实施例3，验证oa激活gpbar1行使camp信号通路的唯一性
本实施例步骤参照实施例2中第一，第二步，
第三步，加药。转染6h后换液，加入500μl/well含有10％fbs的dmem培养基，培养基中预先混合了一定浓度的oa(20μm)以及不同浓度的pka抑制剂h89
第四步，检测。48h后检测报告基因seap。实验结果见图3。
本实施例的实验结果及附图，表明oa激活gpbar1后，相对唯一性地激活camp信号通路的，其他通路相对绝缘，说明本发明所设计的基因环路特异性高。
实施例4，oa特异性激活gpbar1
本实施例步骤参照实施例2中第一，第二步。同样的转染方法pegfp-n1(或者pkzy73:psv40-ctaar1-pasv40,phir-wt)，pxs13和pmf111以配比(1:20:20)与pei转染试剂(质粒与pei质量比1:3)转染，作为对照实验组。
第三步，加药。转染6h后换液，加入500μl/well含有20μm的oa以及10％fbs的dmem培养基，继续培养48h检测报告基因seap，实验结果见图4。
本实施例的实验结果及附图，表明oa激活gpbar1具有严格的选择特异性，说明本发明所设计的基因环路特异性高。
实施例5，模拟健康野生型小鼠体内总胆汁酸的含量及浓度激活gpbar1与oa激活作用对比实验
本实施例步骤参照实施例2中第一，第二步，
第三步，加药。转染6h后换液，加入500μl/well含有10％fbs的dmem培养基，培养基中预先混合了一定浓度的oa(10μm)以及不同浓度的bas(五种主要成分的混合物)，具体剂量参照文献rebeccaa.haeusler，diabetes62:4184–4191,2013
第四步，检测。48h后检测报告基因seap。实验结果见图5。
本实施例的实验结果及附图，表明正常健康个体的血液胆汁酸水平不足以激活gpbar1，说明本发明所设计的基因环路具有严格的可控制性，在正常生理状况该基因环路不会被激活。
实施例6，在hek-293细胞中调控转基因表达的优化研究，利用不同启动子的gpbar1表达载体，对基因环路的优化
本实施例步骤参照实施例4，其中涉及到的质粒共转情况pxs16(puc57::gpbar1)，pxs20(pnfat-gpbar1-pa)，pxs21(pare-gpbar1-pa)，pxs22(phcre-gpbar1-pa)，pxs23(phcrem-gpbar1-pa)，pxs24(pteto7-gpbar1-pa)，pxs25(pcmv-gpbar1-pa)，pxs26(psv40-gpbar1-pa)，pxs43(pnf-κb-gpbar1-pa)和pxs13，pmf111以不同质量配比的同时给予oa(20μm)刺激，实验结果见图6。
本实施例的实验结果及附图，表明用不同启动子诱导表达gpbar1受体，所产生的效果不同，其中在hek-293细胞中以pxs25(pcmv-gpbar1-pa)最佳，说明本发明所设计的基因环路适用性广。
实施例7，本发明的基因环路输出信号在不同细胞系中工作情况
本实施例中涉及到的细胞系有hela，cho-k1，hek-293t，hana3a，hmsc-tert等，分别共转pxs25、pxs13和pmf111，步骤参照实施例4。
本实施例的实验结果及附图，表明不同细胞系中基因环路的表达情况有所差异，在不同的细胞系中可以选择特定的基因环路配置，说明本发明所设计的基因环路选择性好，细胞系适用面广。
实施例8，本发明的基因环路输出信号在一定浓度范围条件下的对oa剂量依赖性，即oa标准品精准调控转基因表达
本实施例步骤参照实施例4，实验结果见图8。
本实施例的实验结果及附图，表明oa激活gpbar1具有严格的剂量依赖性，说明本发明可以实现对基因环路的精准调控转基因表达。
实施例9，本发明的基因环路输出信号在对oa药片萃取物也有剂量依赖性，即oa药片萃取物精准调控转基因表达
本实施例步骤参照实施例4，药片经过乙醇萃取，根据oa在乙醇中室温下的饱和溶解度，配置不同浓度的药物培养液，实验结果见图9。
本实施例的实验结果及附图，表明oa激活gpbar1具有严格的剂量效应，说明本发明可以通过简单易得的oa药片来实现对基因环路的精准调控转基因表达。
实施例10，oa精准调控报告基因egfp的表达
本实施例步骤参照实施例4，其中将报告基因换成egfp，可直观显示报告基因表达。实验结果见图10。
本实施例的实验结果及附图，表明利用egfp报告可以直观显示报告基因表达情况，说明本发明可控制性好。
实施例11，系统的可逆性检测
第一步，种细胞。将收集好的hek-293t细胞，以每孔2x105个细胞，种在6孔板中，加2ml/well含10％fbs的dmem培养基。
第二步，转染。在种细胞后12h到24h内进行转染(确保细胞贴壁，生长状况良好)，在保证质粒总量1.5μg/well的情况下，将质粒pxs25、pxs13、pmf111以最优配比(1:20:20)与pei转染试剂(质粒与pei质量比1:3)加无血清的dmem混匀，总体积200μl/well，室温静置15min后滴加到培养板中。
第三步，加药。转染6h后换液，其中“on-off-on组”加入2ml/well含有20μm的oa以及10％fbs的dmem培养基，6h后更换培养基(不含oa)，及去除oa，分别在12h，24h检测seap；24h处更换培养基(不含oa)继续培养分别在36h，48h检测seap；48h处更换培养基(不含oa)继续培养分别在60h，72h检测seap。
“off-on-off组”加入2ml/well含有10％fbs的dmem培养基，6h后更换培养基(不含oa)，及去除oa，分别在12h，24h检测seap；24h处更换培养基(含oa20μm)继续培养分别在36h，48h检测seap；48h处更换培养基(不含oa)继续培养分别在60h，72h检测seap
实验结果见图11。
本实施例的实验结果及附图，表明可以通过控制oa的存在与否，来实现基因环路从开到关再到开，以及从关到开再到关等复杂调控过程，说明本发明的基因环路可逆性极好。
实施例12，oa的不同刺激时间对基因环路输出的影响
本实施例步骤参照实施例4，通过控制oa在体系中的时间，从而控制刺激时间，反映出oa在不同刺激时间下基因环路的工作情况，体现出系统对oa诱导刺激时间的正相关依赖性。实验结果见图12。
本实施例的实验结果及附图，表明本发明的可控制性良好。
实施例13，dox关闭基因环路输出的剂量依赖性，即dox精准调控转基因表达
本实施例步骤参照实施例8中第一，第二步。
第三步，加药。转染6h后换液，加入500μl/well含有10％fbs的dmem培养基，培养基中预先混合了一定浓度的oa(20μm)以及不同浓度的dox。
第四步，检测。分别在加药后24h，48h，72h时间点检测报告基因seap。实验结果见图13。
本实施例的实验结果及附图，表明dox对系统的控制具有严格的剂量依赖性，说明本发明可以通过dox剂量关闭转基因表达，实现对基因环路的精准调控转基因表达。
实施例14，oa与dox同时调控基因环路输出
本实施例步骤参照实施例11中第一，第二步。
第三步，加药。转染6h后换液，加入2ml/well含有10％fbs的dmem培养基，培养基中预先混合了一定浓度的oa(20μm)以及5ng/ml浓度的dox
第四步，检测。分别在加药后6h，12h，24h，36h，48h等时间点撤去dox，同时在各个时间点检测报告基因seap。本实施例表明系统可以在oa与dox的作用下实现“关”和“开”的切换。实验结果见图14。
本实施例的实验结果及附图，表明oa与dox的配合使用可以实现对基因环路的精准调控转基因表达。
实施例15，本发明基因环路工程化细胞的微胶囊制备
第一步，种细胞。将收集好的细胞，以每孔5x106个细胞，种在15cmdish中，加25ml/dish含10％fbs的dmem培养基。
第二步，转染。在种细胞后12到24h内进行转染(确保细胞贴壁，生长状况良好)，在保证质粒总量30μg/dish的情况下，将质粒pxs25、pxs13、pmf111以最佳优化配比(1:20:20)与pei转染试剂(质粒与pei质量比1:3)加无血清的dmem混匀，总体积2.5ml/dish，室温静置15min后滴加到培养皿中。
第三步，微胶囊化。收集细胞，转染6h后换液，加入20ml/dish含有10％fbs的dmem培养基，再继续孵育6h，胰酶消化，离心收集细胞。微胶囊制备，利用微胶囊制备仪inotechencapsulatorresearchunitie-50r和alginate-polylysine-alginate-membrane微胶囊包裹系统，对转载有质粒pxs25、pxs13、pmf111的hek-293t细胞进行包装。本实施例具体的微胶囊形成的重要参数如下：装配200μm喷头，以20ml/min注射速度，加以1300hz的超声震动断流和1100v的静电分散，可以形成微胶囊500units/s，微囊大小300-350μm；200-250cells/capsule。实验结果见图15。
本实施例的实验结果及附图，表明本发明所使用的微胶囊包裹技术参数，可以满足本发明基本要求。说明本发明中工程化细胞可以被良好地微胶囊化。
实施例16，oa诱导微胶囊化细胞，精准调控转基因表达
本实施例根据实施例15操作方法，制得的微胶囊在24孔板中进行培养，同时加以不同浓度的oa刺激，体现系统在微胶囊中的工作情况良好。实验结果见图16。
本实施例的实验结果及附图，表明微胶囊化后系统可以保持良好的工作状态，说明本发明已经具备初步体内应用的基本条件。
实施例17，oa标准品在野生型小鼠体内诱导本发明基因环路，精准调控转基因表达
本实施例根据实施例15操作方法，将制得的微胶囊移植到野生型小鼠腹腔，腹腔注射给予不同浓度oa标准品溶液，oa剂量在0、1、10、100mg/kg/d，控制剂量每天注射两次，对照组生理盐水。在治疗48h后，检测seap在小鼠血液中的丰度，实验结果见图17。
本实施例的实验结果及附图，表明本发明已经可以在体内实现转基因的精准调控。
实施例18，oa药片在野生型小鼠体内诱导本发明基因环路，精准调控转基因表达
本实施例根据实施例15操作方法，将制得的微胶囊移植到野生型小鼠腹腔oa药片研磨呈粉状，再利用生理盐水重悬制得的均一悬液给小鼠灌胃，oa剂量在0、1、10、100mg/kg/d，控制剂量每天灌胃两次，对照组生理盐水。在治疗48h后，检测seap在小鼠血液中的丰度，实验结果见图18。
本实施例的实验结果及附图，表明本发明中，安全简单易得的oa药片可以作为调控因子，在体内实现转基因的精准调控。
实施例19，dox关闭本发明基因环路在野生型小鼠中的精准调控转基因表达
本实施例根据实施例15操作方法，将制得的微胶囊移植到野生型小鼠腹腔，腹腔注射给予oa标准品溶液，oa剂量在100mg/kg/d，同时给予不同浓度dox，控制剂量每天注射两次，对照组生理盐水。在治疗48h后，检测seap在小鼠血液中的丰度，实验结果见图19。
本实施例的实验结果及附图，表明本发明中dox可以作为调控因子并关闭转基因表达，在体内实现转基因的精准调控。
实施例20，oa诱导调控基因环路的胰岛素表达治疗i型糖尿病兼肝损伤疾病模型的治疗，显著降低总胆汁酸(t-bas)水平
第一步，i型糖尿病小鼠模型的构建，我们采用多次低剂量链脲霉素(streptozocin，stz，购自sigma公司s0130，18883-66-4)给药法诱导模型。c57bl/6j小鼠50只(来自中国科学院)，8周龄，雄性，按照体重随机分成7组，每组5到10只，其中阴性对照组(5只)、正常对照组(5只)。连续5d腹腔注射溶解有stz的柠檬酸钠缓冲液，小鼠stz给药剂量在40-50mg/kg，注射前禁食12-16h(理论上禁食时间越长对胰岛细胞的破坏就越大，但同时要防止小鼠低血糖死亡)，不禁水。注射时将stz溶于新鲜的柠檬酸缓冲液中(0.1mol/l，ph4.5)，避光冰上配制，溶解后尽量在30min内完成注射。阴性对照组腹腔注射柠檬酸缓冲液，正常对照组不作处理。
第二步，在i型糖尿病小鼠成模的基础上继续造肝损伤模型，利用ccl4造模，ccl4导致肝损伤的主要机制目前认为与其自身和自由基代谢产物有关。
ccl4橄榄油溶液的配置，用微量移液器分别取10μlccl4加入5ml橄榄油，混合均匀，配置体积分数为0.2％的ccl4橄榄油溶液，于通风橱操作，现用现配采用不同浓度的ccl4橄榄油溶液，对实验组小鼠进行单次腹腔注射(10ml/kg)，正常对照组给予等体积的橄榄油作为对照。具体实施见下表2。
表2
本发明中利用上述方案造模成功率100％，实验期间没有小鼠死亡，小鼠糖尿病血糖指标，以及肝损伤相关的alt、ast和总胆汁酸等生理指标较阴性对照有极显著差异。
第三步，种细胞。将收集好的细胞，以每孔5x106个细胞，种在15cmdish中，加25ml/dish含10％fbs的dmem培养基。
第四步，转染。在种细胞后12到24h内进行转染(确保细胞贴壁，生长状况良好)，在保证质粒总量30μg/dish的情况下，将质粒pxs25(pcmv-gpbar1-pa)、pxs13(pcmv-tetr-linker-hcreb1-pa)、pxs36(pteto7-seap-2a-proinsulin-pa)以最佳优化配比(1:20:20)与pei转染试剂(质粒与pei质量比1:3)加无血清的dmem混匀，总体积2.5ml/dish，室温静置15min后滴加到培养皿中。
第五步，收集细胞。转染6h后换液，加入20ml/dish含有10％fbs的dmem培养基，再继续孵育6h，胰酶消化，离心收集细胞。
第六步，微胶囊化。同实施例15制备微胶囊，将制备好的微胶囊利用者无血清培养基重悬至每ml约含5x104个微囊，然后按照2x106capsules/kg小鼠体重腹腔注射，每次注射都要尽量轻柔地混匀重悬，以确保每只小鼠携带有的微胶囊的数量一定。按照实施例18中的给药方法，给小鼠灌胃oa剂量在50mg/kg/d。
第七步，在48h时间点通过眼球内眦取血，检测小鼠肝损伤指标，seap表达，insulin表达，以及糖耐受试验。
结果表明本发明的基因环路系统可以很好的通过oa调控表达胰岛素，治疗i型糖尿病，同时可以有效减缓肝损伤。总胆汁酸(t-bas)(t-baskit；biosino&biotechnologyscienceinc.,beijing,china,cat.no.0300)，实验结果数据见图20(t-bas)。
本实施例的实验结果及附图，表明本发明同时治疗肝损伤和改善i型糖尿病的应用中，oa部分的肝保护作用显著有效。
实施例21，oa诱导调控基因环路的胰岛素表达治疗i型糖尿病兼肝损伤疾病模型的治疗，显著降低ast水平。
本实施例具体步骤同实施例20，ast检测(astkit；biosino&biotechnologyscienceinc.,beijing,china,cat.no.0020)，实验结果数据见图21(ast)。
表明本发明同时治疗肝损伤和改善i型糖尿病的应用中，oa部分的肝保护作用显著有效。
实施例22，oa诱导调控基因环路的胰岛素表达治疗i型糖尿病兼肝损伤疾病模型的治疗，显著降低alt水平
本实施例具体步骤同实施例20，alt检测(altkit；biosino&biotechnologyscienceinc.,beijing,china,cat.no.0010)，实验结果数据见图22(alt)。
表明本发明同时治疗肝损伤和改善i型糖尿病的应用中，oa部分的肝保护作用显著有效。
实施例23，oa诱导调控基因环路的胰岛素表达治疗i型糖尿病兼肝损伤疾病模型的治疗，糖耐受实验，表明系统可以有效改善高血糖症状
本实施例具体步骤同实施例20，糖耐受实验方法具体如下：
第一步，给小鼠禁食16小时
第二步，根据每只小鼠的体重，计算葡糖剂量1.25g/kg体重，配制葡萄糖水溶液125mg/ml
第三步，测量每只小鼠的0点血糖，注射葡萄糖溶液，腹腔注注射体积＝bw(g)x10ul,125mg/ml的葡萄糖溶液
第四步，测量每只小鼠30，60，90，120min的血糖值，统计数据。
实验结果数据见图23(糖耐受试验)。
表明本发明同时治疗肝损伤和改善i型糖尿病的应用中，oa诱导基因环路表达的功能蛋白胰岛素，有显著的改善i型糖尿病症状效果。
实施例24，oa诱导调控基因环路的胰岛素表达治疗i型糖尿病兼肝损伤疾病模型的治疗，系统可以有效改善过度饮食症状
本实施例具体步骤同实施例20，实验结果数据见图24(控制饮食)。
表明本发明同时治疗肝损伤和改善i型糖尿病的应用中，oa诱导基因环路表达的功能蛋白胰岛素，有显著的改善i型糖尿病症状效果。
实施例25，oa诱导调控基因环路的胰岛素表达治疗i型糖尿病兼肝损伤疾病模型的治疗，系统可以有效改善过度饮水症状
本实施例具体步骤同实施例20，实验结果数据见图25(控制饮水)。
表明本发明同时治疗肝损伤和改善i型糖尿病的应用中，oa诱导基因环路表达的功能蛋白胰岛素，有显著的改善i型糖尿病症状效果。
实施例26，db/db小鼠的肝功能异常鉴定
本实施例中，我们对天然的糖尿病兼并肝功能异常的小鼠模型，db/db小鼠模型进行验证鉴定，具体ast和alt检测方法及步骤同实施例21和实施例22，实验结果数据见图26(ast，alt)。
本实施例的实验结果及附图，表明本发明所利用的db/db小鼠模型，是兼有肝脏病变和ii型糖尿病的天然模型。
实施例27，在体外，验证本发明的基因环路经oa诱导调控表达glp-1
第一步，种细胞。将收集好的hek-293t细胞，以每孔5x104个细胞，种在24孔板中，加500μl/well含10％fbs的dmem培养基。
第二步，转染。在种细胞后12到24h内进行转染(确保细胞贴壁，生长状况良好)，在保证质粒总量0.3μg/well的情况下，将质粒pxs25(pcmv-gpbar1-pa)、pxs13(pcmv-tetr-linker-hcreb1-pa)、phy73(pteto7-glp-1-iggfc-pa)以最优配比(1:20:20)与pei转染试剂(质粒与pei质量比1:3)加无血清的dmem混匀，总体积50μl/well，室温静置15min后均匀滴加到培养板中。
第三步，加药。转染6h后换液，分别更换事先已经配制的不同浓度梯度的oa(含有10％fbs)的dmem培养基，继续培养48h，用glp-1(7-36)activieelisa试剂盒(milliporecorporation,billerica,ma01821usa,cat.no.eglp-35k,lot.no.2639195)，检测培养基上清glp-1(activie)含量。实验数据详见图27。
本实施例的实验结果及附图，表明在体外，本发明所利用的功能蛋白分子glp-1可以通过oa精准调控表达。
实施例28，在野生型小鼠体内，验证本发明的基因环路经oa诱导调控表达glp-1
第一步，种细胞。将收集好的细胞，以每皿5x106个细胞，种在15cmdish中，加25ml/dish含10％fbs的dmem培养基。
第二步，转染。在种细胞后12到24h内进行转染(确保细胞贴壁，生长状况良好)，在保证质粒总量30μg/dish的情况下，将质粒pxs25、pxs13、phy73以最佳优化配比(1:20:20)与pei转染试剂(质粒与pei质量比1:3)加无血清的dmem混匀，总体积2.5ml/dish，室温静置15min后滴加到培养皿中。
第三步，收集细胞。转染6h后换液，加入20ml/dish含有10％fbs的dmem培养基，再继续孵育6h，胰酶消化，离心收集细胞。
第四步，微胶囊化。同实施例15制备微胶囊，将制备好的微胶囊利用者无血清培养基重悬至每ml约含5x104个微囊，然后按照2x106capsules/kg小鼠体重腹腔注射，每次注射都要尽量轻柔地混匀重悬，以确保每只小鼠携带有的微胶囊的数量一定。按照实施例18中的给药方法，给小鼠灌胃oa剂量分别在0、10、100mg/kg/d。
第五步，检测。在48h时间点通过眼球内眦取血，用glp-1(7-36)activieelisa试剂盒(milliporecorporation,billerica,ma01821usa,cat.no.eglp-35k,lot.no.2639195)，检测培养基上清glp-1(activie)含量。实验数据详见图28。
本实施例的实验结果及附图，表明在体内，本发明所利用的功能蛋白分子glp-1可以通过oa精准调控表达。
实施例29，oa诱导调控基因环路的glp-1表达治疗ii型糖尿病兼肝功能异常疾病模型的治疗，显著降低ast水平
本实施例中，工程化细胞的微胶囊制备具体操作，同实施例28。
然后将微胶囊按照2x106capsules/kg小鼠体重腹腔注射，每次注射都要尽量轻柔地混匀重悬，以确保每只db/db小鼠携带有的微胶囊的数量一定。按照实施例18中的给药方法，给小鼠灌胃oa剂量分别在0、100mg/kg/d,。在48h时间点通过眼球内眦取血，用ast试剂盒检测(astkit；biosino&biotechnologyscienceinc.,beijing,china,cat.no.0020)ast含量。实验数据详见图29。
表明本发明同时治疗肝损伤和改善ii型糖尿病的应用中，oa与glp-1的联合肝保护作用显著有效。
实施例30，oa诱导调控基因环路的glp-1表达治疗ii型糖尿病兼肝功能异常疾病模型的治疗，显著降低alt水平
本实施例中具体操作同实施例29
alt检测(altkit；biosino&biotechnologyscienceinc.,beijing,china,cat.no.0010)。实验数据详见图30。
表明本发明同时治疗肝损伤和改善ii型糖尿病的应用中，oa与glp-1的联合肝保护作用显著有效。
实施例31，oa诱导调控基因环路的glp-1表达治疗ii型糖尿病兼肝功能异常疾病模型的治疗，显著降低ast/alt水平，改善肝功能异常
本实施例综合实施例29和实施例30数据，计算ast/alt的值。实验数据详见图31。
表明本发明同时治疗肝损伤和改善ii型糖尿病的应用中，oa与glp-1的联合肝保护作用显著有效。
实施例32，在db/db糖尿病兼肝功能异常的小鼠模型体内，验证本发明的基因环路经oa诱导调控表达glp-1
本实施例中具体操作同实施例29
在48h时间点通过眼球内眦取血，用glp-1(7-36)activieelisa试剂盒(milliporecorporation,billerica,ma01821usa,cat.no.eglp-35k,lot.no.2639195)，检测培养基上清glp-1(activie)含量。实验数据详见图32。
表明本发明同时治疗肝损伤和改善ii型糖尿病的应用中，所调控表达的功能因子glp-1的糖尿病治疗作用显著有效。
实施例33，oa诱导调控基因环路的glp-1表达治疗ii型糖尿病兼肝功能异常疾病模型的治疗，糖耐受实验
本实施例中具体操作同实施例23。实验数据详见图33。
表明本发明同时治疗肝损伤和改善ii型糖尿病的应用中，所调控表达的功能因子glp-1的糖尿病治疗作用显著有效，即对ii型糖尿病的高血糖症状具有良好的改善控制作用。
实施例34，oa诱导调控基因环路的glp-1表达治疗ii型糖尿病兼肝功能异常疾病模型的治疗，胰岛素耐受实验
第一步，给小鼠禁食4小时
第二步，根据每只小鼠的体重，计算胰岛素剂量1.1u/kg体重，胰岛素溶液配制方法，0.1u/ml(将16.6ul浓度为10mg/ml的胰岛素溶液加入到40ml的pbs中配制)
第三步，测量每只小鼠的0点血糖，注射葡萄糖溶液，腹腔注注射体积＝bw(g)x11ul,0.1u/ml胰岛素溶液
第四步，测量每只小鼠30，60，90，120min的血糖值，统计数据实验数据详见图34。
表明本发明同时治疗肝损伤和改善ii型糖尿病的应用中，所调控表达的功能因子glp-1的糖尿病治疗作用显著有效，即对ii型糖尿病的胰岛素抵抗症状具有良好的改善作用。
实施例35，oa诱导调控基因环路的glp-1表达治疗ii型糖尿病兼肝功能异常疾病模型的治疗，胰岛素耐受指数计算
计算公式为：空腹血糖水平(fpg，mmol/l)×空腹胰岛素水平(fins，miu/l)/22.5。参考turnerrc等人在1985年发表在metabolism题目为“insulindeficiencyandinsulinresistanceinteractionindiabetes:estimationoftheirrelativecontributionbyfeedbackanalysisfrombasalplasmainsulinandglucoseconcentrations.”的文献。实验数据详见图35。
表明本发明同时治疗肝损伤和改善ii型糖尿病的应用中，所调控表达的功能因子glp-1的糖尿病治疗作用显著有效，即对ii型糖尿病的胰岛素抵抗症状具有良好的改善作用。
实施例36，齐墩果酸的异构体熊果酸(ua)，同样也可以激活齐墩果酸基因电路控制系统。因此也可通过ua调控报告基因的精确表达。
本实施例具体步骤参照实施例8，实验数据详见图36。
本实施例的实验结果及附图，表明齐墩果酸的异构体熊果酸(ua)，同样也可以激活齐墩果酸基因电路控制系统，即也可通过ua调控报告基因的精确表达。
注释：限制性酶切位点由下划线标出，退火组装所用的黏性末端由小写字母区分
英文缩写：pcr,polymerasechainreaction(聚合酶链式反应)；mcs,multiplecloningsite(多克隆位点)；egfp,enhancedgreenfluorescentprotein(增强型绿色荧光蛋白)；pa,polyadenylationsignal(多聚腺嘌呤信号)；phcmv,humancytomegalovirusimmediateearlypromoter(人源巨细胞病素早期启动子)；pcre,syntheticmammalianpromotercontainingacamp-responseelement(cre-phcmvmin)(合成的响应哺乳动物细胞camp信号的启动子)；pmcre,modifiedpcrevariant(pcre突变优化后可减少基因泄露的启动子)；cre,camp-responseelement(camp信号响应的顺式作用元件)；mcre,modifiedcamp-responseelement(camp信号响应的顺式作用元件突变型)；phcmvmin,minimalversionofphcmv(phcmv启动子的紧缩突变型)；phcmv*-1,tetracycline-responsivepromoter(teto7-phcmvmin)(四环素响应的启动子)；psv40,simianvirus40promoter(猿猴病毒40启动子)；pnfat,nuclearfactorofactivatedtcellsresponsepromoter(t细胞激活响应的核转录因子启动子)；tetr,escherichiacolitn10-derivedtetracycline-dependentrepressorofthetetracyclineresistencegene(大肠杆菌tn10系列衍生的四环素抗性基因的依赖性响应因子)；teto7,tetr-specificheptamericoperatorsequence(tetr特异识别的7重复操纵序列)；krab,thekrueppel-associatedbox(克吕佩尔相关性蛋白结合域)；creb1,cyclicamp-responsiveelementbindingprotein1(camp应答原件结合蛋白1)；tetr-creb1,tetr-creb1fusionprotein(tetr和creb1融合的重组转录因子)；seap,humanplacentalsecretedalkalinephosphatase(人类胎盘可分泌性碱性磷酸酶)；ctaar,chimerictrace-amine-associatedreceptor1(嵌合型胺关联性受体1)；glp-1,glucagon-likepeptide1(胰高血糖素样肽1)；glp-1-r,glucagon-likepeptide1receptor(胰高血糖素样肽1受体)；gpbar1,humangprotein-coupledbileacidreceptor1(genbank:bc033625)(人源的胆汁酸g蛋白偶联受体)；are,antioxidantresponseelement(抗氧化反应原件)；2a,2aoligopeptidesareautonomouselementscontainingad(v/i)exnpgpmotifatthecterminus(源自口蹄疫病毒的多顺反子表达过程中的功能性多肽，能在其c末端介导多聚蛋白的剪切)；preproinsulin,ahumanproinsulinmoleculewithasignalpeptideattachedtoitsn-terminus(人胰岛素前体蛋白原)；pnf-κb,operatorsequencefornuclearfactorkappa-light-chain-enhancerofactivatedbcells(活化b细胞中的一种调控因子复合体，所识别的操纵子序列)。