本发明涉及一种刺激隐核虫幼虫膜蛋白单克隆抗体的制备方法。
背景技术：
刺激隐核虫是对海水鱼养殖业危害最大的寄生虫之一，能感染大多数海水鱼品种，造成大量死亡。通过免疫刺激后鱼体能够对刺激隐核虫产生免疫保护，疫苗免疫可能是未来防治刺激隐核虫病的一个很好选择。由于难以通过体外培养获得到大量的全虫抗原来制备该虫的疫苗，因此制备亚单位疫苗成为实现刺激隐核虫病免疫防控的一个主要途径，尝试建立刺激隐核虫幼虫膜蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株，以期用于刺激隐核虫功能性蛋白的筛选和功能分析，为亚单位疫苗的研发提供依据。
技术实现要素：
本发明提出一种刺激隐核虫幼虫膜蛋白单克隆抗体的制备方法。
一种刺激隐核虫幼虫膜蛋白单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
（1）将孵化的幼虫冰浴30 min；并在4℃环境下8000rpm离心10 min沉淀幼虫；
（2）用洗涤液重悬沉淀，并在4℃5000 rpm离心10 min，重复2次；
（3）加入蛋白提取液，并加入l‰体积的1 mol／L DDT和蛋白酶抑制剂置于冰上，100 w超声破碎；
（4）装入1．5 mL离心管，冰上放置10 min，期间取出剧烈震荡2至3次，于4℃，14000 rpm离心10 min，弃去沉淀，上清转移至新管；
（5）将上清置于37℃水浴10 min，可见液体出现雾化混浊或分层，再室温或者37℃12000 rpm离心5 min，液体分为两层；
（6）小心吸去上次水相，取下层，加入500 冰冷灭菌水，混匀后冰浴5 min，再置于37℃水浴10min；
（7）室温环境下以12000rpm离心5 min，最终得到的下层即为膜蛋白提取物；
（8）初次免疫，将提取的刺激隐核虫幼虫膜蛋白与等量的弗氏完全佐剂混匀，充分震荡乳化，采用腹腔注射方法，每只Balb／c小鼠注射0．2 mL(约含100弘g抗原)；
（9）2周后进行二次免疫，将提取的刺激隐核虫幼虫膜蛋白与等量的弗氏不完全佐剂混匀，乳化，每只小鼠注射0．2 mL(约含100／lg抗原)；
（10）第三次免疫安排在杂交融合前4 d，用0．2 mL的刺激隐核虫幼虫膜蛋白(约含200 ug)进行免疫，不加佐剂；
（11）在三免后第4d，对受免疫Balb／c小鼠和阴性鼠摘眼球采血，制备血清后即得抗体。
优选地，所述差声波破碎的方式为每次工作时间10s，间隔15S，做60个循环。
本发明所述方法制备的抗体能够分泌特异性识别刺激隐核虫膜蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株，为刺激隐核虫功能性蛋白的分离和筛选提供了保证。
具体实施方式
实施例1。
一种刺激隐核虫幼虫膜蛋白单克隆抗体的制备方法括以下步骤：
（1）将孵化的幼虫冰浴30 min；并在4℃环境下8000rpm离心10 min沉淀幼虫；
（2）用洗涤液重悬沉淀，并在4℃5000 rpm离心10 min，重复2次；
（3）加入蛋白提取液，并加入l‰体积的1 mol／L DDT和蛋白酶抑制剂置于冰上，100 w超声破碎；
（4）装入1．5 mL离心管，冰上放置10 min，期间取出剧烈震荡2至3次，于4℃，14000 rpm离心10 min，弃去沉淀，上清转移至新管；
（5）将上清置于37℃水浴10 min，可见液体出现雾化混浊或分层，再室温或者37℃12000 rpm离心5 min，液体分为两层；
（6）小心吸去上次水相，取下层，加入500 冰冷灭菌水，混匀后冰浴5 min，再置于37℃水浴10min；
（7）室温环境下以12000rpm离心5 min，最终得到的下层即为膜蛋白提取物；
（8）初次免疫，将提取的刺激隐核虫幼虫膜蛋白与等量的弗氏完全佐剂混匀，充分震荡乳化，采用腹腔注射方法，每只Balb／c小鼠注射0．2 mL(约含100弘g抗原)；
（9）2周后进行二次免疫，将提取的刺激隐核虫幼虫膜蛋白与等量的弗氏不完全佐剂混匀，乳化，每只小鼠注射0．2 mL(约含100／lg抗原)；
（10）第三次免疫安排在杂交融合前4 d，用0．2 mL的刺激隐核虫幼虫膜蛋白(约含200 ug)进行免疫，不加佐剂；
（11）在三免后第4d，对受免疫Balb／c小鼠和阴性鼠摘眼球采血，制备血清后即得抗体。
实施例2。
一种刺激隐核虫幼虫膜蛋白单克隆抗体的制备方法括以下步骤：
（1）将孵化的幼虫冰浴30 min；并在4℃环境下8000rpm离心10 min沉淀幼虫；
（2）用洗涤液重悬沉淀，并在4℃5000 rpm离心10 min，重复2次；
（3）加入蛋白提取液，并加入l‰体积的1 mol／L DDT和蛋白酶抑制剂置于冰上，100 w超声破碎；
（4）装入1．5 mL离心管，冰上放置10 min，期间取出剧烈震荡2至3次，于4℃，14000 rpm离心10 min，弃去沉淀，上清转移至新管；
（5）将上清置于37℃水浴10 min，可见液体出现雾化混浊或分层，再室温或者37℃12000 rpm离心5 min，液体分为两层；
（6）小心吸去上次水相，取下层，加入500 冰冷灭菌水，混匀后冰浴5 min，再置于37℃水浴10min；
（7）室温环境下以12000rpm离心5 min，最终得到的下层即为膜蛋白提取物；
（8）初次免疫，将提取的刺激隐核虫幼虫膜蛋白与等量的弗氏完全佐剂混匀，充分震荡乳化，采用腹腔注射方法，每只Balb／c小鼠注射0．2 mL(约含100弘g抗原)；
（9）2周后进行二次免疫，将提取的刺激隐核虫幼虫膜蛋白与等量的弗氏不完全佐剂混匀，乳化，每只小鼠注射0．2 mL(约含100／lg抗原)；
（10）第三次免疫安排在杂交融合前4 d，用0．2 mL的刺激隐核虫幼虫膜蛋白(约含200 ug)进行免疫，不加佐剂；
（11）在三免后第4d，对受免疫Balb／c小鼠和阴性鼠摘眼球采血，制备血清后即得抗体；
（12）所述差声波破碎的方式为每次工作时间10s，间隔15S，做60个循环。