1.一种永生化的牛精原干细胞系,其特征在于,是以牛精原干细胞作为宿主细胞,通过用pLOX-Ttag-iresTK慢病毒表达载体表达的慢病毒转导,转导后的牛精原干细胞表达SV40大T抗原,成为具有多向分化潜能的转化体。
2.如权利要求1所述的永生化的牛精原干细胞系,其特征在于,其细胞为成纤维样,呈多角形和短梭状,有两个或两个以上的核仁,细胞间存在接触抑制。
3.如权利要求1所述的永生化的牛精原干细胞系,其特征在于,牛精原干细胞系在传代培养35代以后SV40大T抗原还能够被表达。
4.一种永生化的牛精原干细胞系的构建方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)将预处理的睾丸组织剪碎,加入10倍体积的CDD溶液中消化处理;然后等体积中和液中和,室温离心后弃上清,用DMEM+10%FBS+2mmol/L谷氨酰胺+100μmol/Lβ-巯基乙醇的溶液重新悬浮细胞后接种于培养皿上,37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养,再采用免疫磁珠抗体CD90分选获取纯化的牛精原干细胞;
所述的CDD溶液包含2mg/mL胶原酶、20μg/mL DNase和2mg/mL Dispase;
所述的中和液为DMEM/F12+10%胎牛血清;
2)将pLOX-Ttag-iresTK慢病毒表达载体与pVSVG和pPAX2的复合物作为转染液,将其转染于接种于培养板上的293T细胞;
48h后收取病毒液,过滤除去细胞碎片;将牛精原干细胞按照1×105细/35mm皿接种于培养皿上,12h后将病毒液含有10μg/mL polybrene的溶液加入皿中,24h后换上新鲜的培养液连续培养、传代3个月以上,得到永生化的牛精原干细胞系。
5.如权利要求4所述的永生化的牛精原干细胞系的构建方法,其特征在于,所述的睾丸组织的处理为:
将3月龄以上的睾丸组织经高浓度双抗清洗(300U/ml青霉素,300mg/mL链霉素)后转移到细胞培养室,经75%医用酒精浸泡1-2min;剪开白膜及睾丸组织,取出部分组织浸泡于PBS中,反复清洗3-4次后用剪刀剪碎。
6.如权利要求4所述的永生化的牛精原干细胞系的构建方法,其特征在于,所述精原干细胞的纯化是原代差速贴壁法分离收集未贴壁的精原细胞,将收集的未贴壁精原细胞按如下步骤进行细胞分选:
1)未贴壁精原细胞1200rpm室温离心5min,弃去培养液;
2)离心所得细胞用PBS重悬后计数,按1×107/管分装,1200rpm室温离心5min,弃去PBS;
3)离心沉淀所得细胞用20μL的CD90磁珠抗体加80μL的MACS Buffe重悬,4度孵育15min;
4)孵育细胞1200rpm室温离心5min,收集上层一抗稀释液;
5)细胞沉淀再用500μL MACS Buffer重悬成细胞悬液,用500μL MACS Buffer润洗MACS分选柱,待润洗的MACS Buffer将要流完时,及时缓慢滴加细胞悬液;
6)收集流过分选柱的细胞悬液,获得CD90阴性精原细胞;
待细胞悬液完全流过MACS分选柱后,再用500μL MACS Buffer缓慢润洗分选柱,然后取下分选柱,再向分选柱中滴加500μL MACS Buffer,收集用助推活塞推出的MACS Buffer,其中含有CD90阳性精原细胞,收集分选的牛精原干细胞接种到铺了Laminin上含有低血清的培养基中培养,其培养基组成成分为:DMEM/F12+10%KSR+0.1mmol/Lβ-巯基乙醇,2mmol/L谷氨酰胺,1%非必需氨基酸,1%FBS,100U/mL青霉素,100mg/mL链霉素.20ng/mL GDNF,20ng/mL bFGF,10ng/mL LIF。
7.如权利要求4所述的永生化的牛精原干细胞系的构建方法,其特征在于,所述的pLOX-Ttag-iresTKT慢病毒表达载体和慢病毒包装组成成分质粒pVSVG、pAX共同转染293T细胞包装获得假慢病毒感染颗粒,包括以下操作:
1)多聚赖氨酸溶液包被处理细胞培养皿,吸除多聚赖氨酸晾干培养皿后接种107个293T细胞;
2)待次日细胞生长至70-90%铺满培养皿时,换取新鲜温热培养液;
3)按照转染试剂转染体系,取质粒pLOX-Ttag-iresTKT 14μg;pVSVG 7μg;pAX 7μg,依次将转染组分别加入一个无菌洁净的玻璃离心管,混匀室温静置15min后逐滴加到293T细胞培养液中,轻轻摇匀;再换取新鲜培养液后48h收取包含病毒颗粒的细胞上清液,0.45μm滤器过滤去除细胞碎片等杂质;
牛精原干细胞按照1×105细胞/35mm皿,上将牛精原干细胞按照1×105细胞/35mm皿上,12h后将含有10μg/ml polybrene的病毒液溶液加入含有低血清培养皿中,24h后换上新鲜的培养液连续培养、传代3个月以上,直到细胞永生化,永生化后使用含血清的完全培养基;
所述的低血清培养基组成成分为:DMEM/F12+10%KSR+0.1mMβ-巯基乙醇,2mM谷氨酰胺,1%非必需氨基酸,1%FBS,100U/ml青霉素,100mg/ml链霉素.20ng/ml GDNF,20ng/ml bFGF,10ng/ml LIF。永生化的细胞使用的含有血清的完全培养基为DMEM/F12加入10%FBS、1mmol/L丙酮酸钠、0.1mmol/Lβ-巯基乙醇、2mmol/L谷氨酰胺、100U/ml青霉素,100mg/ml链霉素。
8.如权利要求4所述的永生化的牛精原干细胞系的构建方法,其特征在于,通过pLOX-Ttag-iresTK慢病毒表达载体转导致牛精原干细胞得到连续传代3个月以上且能够表达SV40大T抗原。