一种裸鼹鼠雪旺细胞培养方法与流程

本发明涉及细胞生物学技术领域，具体涉及一种细胞的分离纯化及培养方法，特别涉及一种裸鼹鼠雪旺细胞的分离纯化和培养方法。

背景技术：

雪旺细胞(Schwann cell)是脊髓的成髓鞘细胞，其包绕神经元轴突形成的髓鞘结构对神经元有营养、支持及保护作用，并且髓鞘的存在能够保证神经元之间信息传递的速率。未成熟的雪旺细胞可以受到微环境的刺激而再次启动分化。在脊髓横断损伤、肌肉萎缩性侧面硬化病等疾病中一般会伴随有髓鞘的损伤(Billiards SS,Haynes RL,Folkerth RD,Borenstein NS,Trachtenberg FL,Rowitch DH,Ligon KL,Volpe JJ,Kinney HC.2008.Myelin abnormalities without oligodendrocyte loss in periventricular leukomalacia.Brain Pathol 18:153–163.)。

裸鼹鼠是一种变温哺乳动物，在氧气浓度仅有6％左右的不通风洞穴中能够保持脑结构和功能的完整无损并进行正常的生命活动，尤其是耗氧量较高的已经形成髓鞘的雪旺细胞。因此，研究裸鼹鼠脊髓中雪旺细胞特殊的低氧耐受能力对于脊髓损伤性疾病中雪旺细胞损伤的治疗具有重要的指导意义。由于在体微环境非常复杂，无法在体直接观察雪旺细胞在低氧环境中的功能改变情况及其适应机制，并且在体的结果可能容易受到微环境中其他细胞组分和结构的影响。因此需要建立离体的裸鼹鼠雪旺细胞模型以弥补在体观察的缺陷。

未成熟的脊髓来源雪旺细胞具有较强的分裂增殖能力，易于体外培养，并通过诱导其分化的方法得到具有成髓鞘能力的成熟细胞。目前，研究人员已经摸索出诱导大鼠坐骨神经组织来源的雪旺细胞，以及大鼠脊髓DRG神经节来源的雪旺细胞培养方法(Wang Y,Zhou S,Xu H,Yan S,Xu D,Zhang Y.Up-regulation of NF45correlates with Schwann cell proliferation after sciatic nerve crush.J Mol Neurosci.2015May；56(1):216-27.)。

但是现有技术中无论小鼠还是大鼠的雪旺细胞分离纯化和培养方法均不适用于裸鼹鼠，目前国内外文献尚无有关裸鼹鼠雪旺细胞分离纯化和培养方法的相关报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种裸鼹鼠雪旺细胞的分离纯化和培养方法，以方便、高效的获得纯度高、状态好的裸鼹鼠雪旺细胞，为体外建立裸鼹鼠雪旺细胞提供技术支持，同时为体外研究裸鼹鼠雪旺细胞的分化、迁移以及低氧耐受能力、以及裸鼹鼠雪旺细胞低氧耐受机制的阐述和相应治疗药物或靶分子的筛选提供强大的保障。

我们试用了目前小鼠、大鼠的雪旺细胞分离纯化和培养方法，结果发现均无法培养获得纯度高、状态好的裸鼹鼠雪旺细胞，而且裸鼹鼠雪旺体细胞增殖的数量也较少。

关于裸鼹鼠雪旺细胞的培养尚没有建立出可行的实验方法，我们分析其原因，主要是：1)裸鼹鼠是一种变温动物，其体细胞离体培养的温度有待摸索，并且其不恒定的机体代谢速率导致其体细胞体外培养基区别于普通的大鼠或小鼠；2)裸鼹鼠生存在较为阴暗潮湿的环境中，其体细胞的培养对湿度有较高的要求；3)裸鼹鼠已经适应了外界低氧的环境，所以其体细胞离体培养环境中的氧气浓度区别于常氧环境中生活的动物，并且需要摸索。

因此，裸鼹鼠雪旺细胞的培养中最重要的是摸索到合适的温度、湿度和氧气浓度，以及摸索到适合的培养基。

为实现上述目的，本发明提供一种裸鼹鼠雪旺细胞培养方法，包括以下步骤：

A、收集裸鼹鼠DRG混合神经细胞：

分离胚胎期58-65天的裸鼹鼠脊髓DRG神经节，将DRG神经节剪碎，加入组织消化液I混匀之后消化，再用组织消化液II消化；然后用混合神经细胞培养基终止消化，离心去除上清之后，在混合神经细胞培养基中将沉淀重悬并吹打成单细胞悬液；将单细胞悬液种于无菌且预先包被有基质层的培养板中(较优的选择24孔板)；

所述的组织消化液I，可以为常规的蛋白水解酶类消化液，例如I型、II型胶原酶等，辅以DNA酶I以解除DNA片段粘连引起的细胞聚集。优选的组织消化液I为含有0.15％胶原酶和0.03mg/ml DNA酶I的混合液。

所述的组织消化液II，可以为常规的蛋白水解酶类消化液，例如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等，辅以DNA酶I以解除DNA片段粘连所致的细胞聚集。优选的组织消化液II为含有0.25％胰酶和0.03mg/ml DNA酶I的混合液。

所述的基质层，可以为常规的左旋多聚赖氨酸、右旋多聚赖氨酸、胶原蛋白、laminin等。优选的基质层为左旋多聚赖氨酸的基质层。

B、裸鼹鼠DRG混合神经细胞的培养：

将步骤A得到的DRG混合神经细胞，用混合神经细胞培养基培养于三气培养箱中培养24小时后更换新鲜的混合神经细胞培养基，之后每3天换一次培养基；培养25天后换为雪旺细胞纯化培养基进行培养，每三天更新一次培养基。

所述的混合神经细胞培养基可以为常规的含血清混合神经细胞培养液，例如低糖DMEM等。优选为含有体积百分数为15％进口胎牛血清的低糖DMEM培养基。

所述的雪旺细胞纯化培养基为含体积分数为2％B27的Neurobasal并添加质量体积分数为0.01mg/ml的PDGFa。

所述的三气培养箱的参数设置为：温度控制在35±2℃，氧浓度为6％，二氧化碳浓度为5±2％，湿度为96±2％。

优选的，步骤A中，分离胚胎期58-65天的裸鼹鼠脊神经节中DGR组织的方法如下：取怀孕58-65天的雌性裸鼹鼠，将其在CO₂中作窒息处理后立即将其浸泡于75％的乙醇中进行消毒，然后将其置于无菌玻璃平皿中，小心剖腹并将其含有胎鼠的子宫完整取出，剪开子宫膜并小心取出胎鼠。沿胎鼠背部脊柱走向将其剪开，于体式显微镜下暴露椎管和椎间孔，用显微镊逐个摘除两侧椎体的外侧隐窝中圆形透亮的脊神经节，尽量剥除神经节表面的筋膜。

优选的，步骤A中，用显微剪将神经节组织剪碎至1mm³，加入组织消化液I混匀之后，于37℃消化30min，再用组织消化液II于37℃消化30min。然后用2ml混合神经细胞培养基终止消化。随后细胞进行离心并收集细胞沉淀用于重悬为单细胞悬液。

优选的，步骤B中，用混合神经细胞培养基培养24小时，待其完全贴壁之后，更换新鲜的混合神经细胞培养基，之后每3天更换一次培养基。

优选的，所述三气培养箱的参数设置为：温度控制在35℃，氧浓度为6％，二氧化碳浓度为5％，湿度为96％。

优选的，步骤A中，所述左旋多聚赖氨酸浓度为0.01mg/ml。

优选的，步骤B中，所述离心参数设置为室温下，1000rpm，5分钟。

优选的，步骤B中，用混合神经细胞培养基中培养于三气培养箱中31天。

本发明的有益效果在于：A、从裸鼹鼠胎鼠脊神经节中分离并纯化培雪旺细胞，摸索出了适于变温的啮齿类哺乳动物裸鼹鼠雪旺细胞的合理培养方法。我们发现6％氧浓度条件下，细胞状态能够得到较好的保持，并能够保持增长；B、操作方法简单，具有较高的可重复性，细胞纯度可达98％以上。在15％浓度胎牛血清的培养基中，脊神经节中雪旺细胞能保持较高的增殖速率，由于这种增殖优势以及缺乏神经元营养因子的存在，脊神经节中的神经元的生长会受到影响从而导致神经元比例逐渐降低，而雪旺细胞的比例逐渐升高并达到最高纯度。

中国专利文献CN105695409A公开了一种裸鼹鼠少突胶质前体细胞培养方法，但是裸鼹鼠少突胶质前体细胞取材自不含结缔组织的脑组织，而雪旺细胞取自两侧椎体的外侧隐窝的DRG神经节，每个DRG神经节直径不超过1mm，并由一层结缔组织膜包裹，这层结缔组织膜无法利用机械的方法剥除，在分离消化方法上有别于脑组织来源的神经元。因此，在对DRG神经节进行消化时，需要首先利用含有0.1％胶原酶和0.06mg/ml DNA酶I的混合液，即消化液I对DRG神经节表面的结缔组织进行消化。然后，在利用消化液II对DRG神经节内部进行消化，这样能够将DRG神经节进行有效的消化从而提高所获细胞的量。另外，利用CCK8检测细胞增殖速率发现，裸鼹鼠雪旺细胞生长最适的氧浓度不同于少突胶质前体细胞，前者在6％氧浓度时能够保持较高的增殖速率(如表1所示)。

表1.不同氧浓度对裸鼹鼠雪旺细胞增殖速率的影响(OD450)

注：**，P＜0.01，与5％O₂浓度相比。

综上所述，本发明方法能够简便、高效、经济的获得大量功能活性正常的裸鼹鼠雪旺细胞，低氧条件下的培养能够保证这种细胞在离体环境中依然能够保持在体状态下的生物学特性，从而便于直接在纯净的体外细胞培养模型中进一步研究裸鼹鼠雪旺细胞的特殊生理功能，从而为探索其中的生物学机制并应用于临床相关领域提供重要的理论依据。

附图说明

图1为体外培养的雪旺细胞，为200倍放大，其中标尺为20μm。

图2为体外培养的雪旺细胞免疫化学染色鉴定，细胞用S100染色标记，其中标尺为20μm。

图3为体外纯化培养的雪旺细胞免疫细胞化学染色鉴定，细胞用S100染色标记，标尺为20μm。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1：裸鼹鼠雪旺细胞分离纯化及培养

1、实验材料

胚胎期58-65天的裸鼹鼠由中国人民解放军第二军医大学实验动物中心提供。DNA酶I购自Solarbio生物科技有限公司，胰蛋白酶、左旋多聚赖氨酸、PDGFa、青链霉素混合液等购自Sigma公司，DMEM、低糖DMEM、澳洲来源胎牛血清等购自Thermo Fisher Scientific公司，培养皿、T25和T75培养瓶购自Corning公司。

混合神经细胞培养基为含有体积百分数为15％进口胎牛血清的低糖DMEM培养基。

雪旺细胞纯化培养基为含体积分数为2％B27的Neurobasal并添加质量体积分数为0.01mg/ml的PDGFa。

2、裸鼹鼠雪旺细胞分离纯化及培养方法

A、收集裸鼹鼠雪旺细胞：取胚胎期58-65天的裸鼹鼠脊髓DRG神经节，将DRG神经节剪碎，加入组织消化液I(0.25％胰酶和0.03mg/ml DNA酶I的混合液)混匀之后于37℃消化30分钟，再用组织消化液II(含有0.15％胶原酶和0.03mg/ml DNA酶I的混合液)于37℃消化30min；然后用2ml混合神经细胞培养基终止消化，离心去除上清之后，在混合神经细胞培养基中将沉淀重悬并吹打成单细胞悬液；按照1×10⁶密度种于包被有左旋多聚赖氨酸的T25培养瓶中，每瓶培养液体积为4ml；

B、裸鼹鼠雪旺细胞的培养：将A中得到的细胞，用混合神经细胞培养基于三气培养箱中培养20天。自细胞接种之后，每3天采取半量换液法更换新鲜的混合神经细胞培养基。20天后，更换为雪旺细胞纯化培养基(Neurobasal：B27＝50:1，同时添加最终质量体积分数为0.01mg/ml的PDGFa)，即可得到纯化的雪旺细胞，培养于35℃，氧浓度为6％，二氧化碳浓度为5％，湿度为96％的三气培养箱中

实施例2：裸鼹鼠雪旺细胞的鉴定

采用实施例1所得的裸鼹鼠雪旺细胞的鉴定：利用4％多聚甲醛对处于增殖培养基中的雪旺细胞进行固定，并结合形态学鉴定、免疫细化化学等方法进行鉴定。

1、细胞形态学鉴定：

鉴定方法参考文献中所述(Wenjing Yang,Lin Xiao,Cui Li,Xiuyun Liu,Mingdong Liu,Qi Shao,Dan Wang,Aijun Huang and Cheng He.TIP30inhibits oligodendrocyte precursor cell differentiation via cytoplasmic sequestration of Olig1.Glia.2015；63(4):684-98.)。

结果如图2所示，光镜下，雪旺细胞胞体呈圆形或椭圆形，胞体折光度较强，胞体周围有一圈明显的光晕，从胞体向周围伸出二或三极突起。在雪旺细胞纯化培养基中培养24小时后，细胞依然能够保持二或三极突起。

2、免疫细胞化学鉴定：

鉴定方法参考文献中所述(Wenjing Yang,Lin Xiao,Cui Li,Xiuyun Liu,Mingdong Liu,Qi Shao,Dan Wang,Aijun Huang and Cheng He.TIP30inhibits oligodendrocyte precursor cell differentiation via cytoplasmic sequestration of Olig1.Glia.2015；63(4):684-98.)。

结果如图3所示，将差速贴壁纯化的雪旺细胞进行爬片实验，在增殖培养基中培养24小时后，利用4％多聚甲醛将细胞固定，然后利用抗雪旺细胞表面特异抗原S100的抗体进行免疫细胞化学染色。结果显示，在雪旺细胞纯化培养基中，细胞能够保持S100阳性的状态。

根据上述实验结果，本发明分离纯化的裸鼹鼠雪旺细胞具备典型的雪旺细胞形态，呈S100阳性，并且具有典型的双极或三极突起，并在纯化培养基中能够保持良好的增殖状态。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。