本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种益生菌及其制备方法。
背景技术：
益生菌，是一类对宿主有益的活性微生物，是定植于人体肠道、生殖系统内，能产生确切健康功效从而改善宿主微生态平衡、发挥有益作用的活性有益微生物的总称。益生菌对宿主健康起着重要作用，主要包括以下几个方面：一、帮助宿主对营养物质的消化吸收；二、产生维生素、短链脂肪酸及抗氧化剂等重要物质；三、通过抑制有害细菌的生长及清除有害细菌产生的毒素来帮助宿主抵御细菌病毒感染，提升宿主的抵抗力。
目前，人类发现的益生菌大体上可以分为三类：乳酸杆菌、双歧杆菌和革兰氏阳性菌球菌。随着对肠道菌群的了解越来越深入，多数研究表明不同的细菌对不同的疾病人群发挥着不同的作用，提出了需要分离培养出多种化的益生菌这一个市场需求。2004年，由murielderrien等人分离出akkermansia属第一株细菌akkermansiamuciniphila，研究者对akkermansiamuciniphila的功能研究发现该株细菌具有改善肥胖及ⅱ型糖尿病患者的代谢情况，具有减肥降血糖的效果。现有技术中，分离得到的akkermansia属的细菌只有akkermansiamuciniphila这一种，对于该类细菌的分离方法也比较复杂，限制了益生菌的进一步推广应用。
因此，研发出一种益生菌及其制备方法，用于解决现有技术中，益生菌种类单一、分离复杂的技术缺陷，成为了本领域技术人员亟待解决的问题。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明提供了一种益生菌及其制备方法，用于解决现有技术中，益生菌种类单一、分离复杂的技术缺陷。
本发明提供了一种益生菌，所述益生菌的保藏编号为：gdmcc60085。
本发明还提供了一种上述益生菌的制备方法，所述制备方法为：
步骤一、配置菌液：粪便与生理盐水混匀后稀释得稀释液，所述稀释液接种于粘蛋白液体培养基中，培养后得菌液；
步骤二、pcr扩增：以所述菌液为模板，使用针对akkermansia属的引物进行pcr，挑选pcr反应阳性管中的菌液接种于粘蛋白固体培养基上，培养后得菌落；
步骤三、培养纯化菌落。
优选地，所述稀释液中粪便浓度为10-6g/ml，所述稀释液和所述粘蛋白液体培养基的体积比为1:9。
优选地，步骤一中所述培养的条件为：37℃厌氧培养，步骤一中所述培养的时间为4天。
优选地，所述针对akkermansia属的引物包括：引物一和引物二；
所述引物一的序列为cagcacgtgaaggtggggac，所述引物二的序列为ccttgcggttggcttcagat。
优选地，步骤二中所述培养的条件为：37℃厌氧培养，步骤一中所述培养的时间为4天。
优选地，所述培养纯化菌落得方法为：所述菌落接种于巧克力平板上培养后，将巧克力平板上的菌落接种于哥伦比亚血平板上进行纯化培养出菌落
优选地，所述制备方法还包括：测序验证，所述测序验证方法在所述培养纯化菌落步骤后进行。
本发明还提供了一种益生菌固态曲，所述益生菌固态曲由上述益生菌制得。
优选地，所述益生菌固态曲中，所述益生菌的活菌数量为109cfu/g曲。
综上所述，本发明提供了一种益生菌，所述益生菌的保藏编号为：gdmcc60085。本发明还提供了一种上述益生菌的制备方法，所述制备方法为：步骤一、配置菌液；步骤二、pcr扩增：步骤三、培养纯化菌落。本发明还提供了一种益生菌固态曲，所述益生菌固态曲由上述益生菌制得。本发明提供的技术方案中，经全基因测序实验，所制得的菌种可参与碳水化合物代谢以及脂肪代谢，同时还可以产生维生素和短链脂肪酸乙酸，是一种具有良好潜力的益生菌。同时，本发明提供的制备方法简单易操作，适合大规模推广应用。解决了现有技术中，益生菌种类单一、分离复杂的技术缺陷。
生物保藏说明
norzea，分类命名：akkermansiasp.，于2016年10月11日保藏在广东省微生物菌种保藏中心，地址为广州市先烈中路100号大院59号5楼，保藏编号为gdmccno.60085。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为细菌菌落代谢产物中的短链脂肪酸含量的柱状图。
具体实施方式
本发明提供了一种益生菌及其制备方法，用于解决现有技术中，益生菌种类单一、分离复杂的技术缺陷。
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为了更详细说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种益生菌及其制备方法，进行具体地描述。
实施例1
本实施例为制备益生菌的具体实施例。
1.1粘蛋白纯化
1.1.1备料
称取0.2g无水nah2po4、7gna2hpo4·12h2o和6gnacl溶于去离子水中，调节ph为7.8，定容到1000ml，高压125℃条件下灭菌30min制得a液，常温保存。
称取5.85gnacl于去离子水中，调节ph为7.0，定容到1000ml，高压125℃条件下灭菌30min制得b液，常温保存。
1.1.2纯化
称取10～15g粘蛋白粉末，加入到500mla液的烧瓶中，在磁力搅拌器上均匀搅拌2h后，用1m氢氧化钠调整溶液ph为7.2±0.2，滴加500～1000ul甲苯，继续在磁力搅拌器上均匀搅拌18h，3000rpm离心10min，收集上清至另一高压过的烧瓶中，弃去沉淀，向溶液中加入预冷的无水乙醇，使其浓度约为60％。4℃冰箱中放置30min，3000rpm离心10min，收集沉淀，弃掉上清，将沉淀溶于200mlb液中，搅拌6h后，3000rpm离心10min，收集上清至另一高压过的烧瓶中，弃去沉淀，向溶液中加入预冷的无水乙醇，使其浓度为60％。4℃冰箱中放置30min，3000rpm离心10min，收集沉淀，弃掉上清，将沉淀溶于100ml蒸馏水中，4℃密封保存。
1.2液体粘蛋白培养基制备
1.2.1备料
配置酸性微量元素：称取和/或量取1.491gfecl2·4h2o、0.06gh3bo4、0.068gzncl2、0.1725gcucl2·7h2o、0.0635gmncl2、0.0119gcocl2·6h2o、0.0235gnicl2·6h2o和4.18mlhcl，溶于蒸馏水中，定容至100ml。
配置碱性微量元素：称取0.01729gna2seo3、0.0242gna2moo4·2h2o和0.4gnaoh，溶于蒸馏水中，定容至100ml。
配置维生素液：称取0.02g生物素、0.21g维生素b3、0.5g维生素b6、0.1g维生素b2、0.2g维生素b1、0.25g维生素b12和泛酸0.1g，溶于蒸馏水中，定容至100ml。
称取和/或量取1.1gcacl2、1.0gmgcl2、酸性微量元素1ml和碱性微量元素1ml，蒸馏水定容到100ml，高压125℃条件下灭菌30min制得1液，常温密封保存。
称取5.3gna2hpo4、3gnacl和4gkh2po4溶于蒸馏水中，定容至100ml，高压125℃30min，蒸馏水定容到100ml，高压125℃条件下灭菌30min制得2液，常温密封保存。
称取和/或量取2gnahco3和维生素液2ml，蒸馏水定容到100ml，0.22μm滤膜过滤制得3液，4℃密封保存。
称取2.5gna2s，蒸馏水定容到100ml，0.22μm滤膜过滤制得4液，4℃密封保存。
1.2.2配置培养基
取200ml无菌蒸馏水盛于高压过的广口瓶中，在超净工作台中依次加入2ml的1液、2ml的2液、1ml的3液和2ml的4液及纯化后的粘蛋白溶液30-40ml，，每加入一种液体后需摇匀。用电动移液器吸取5ml的液体分装于15ml的离心管中，盖紧管盖，4℃密封保存。
1.3固体粘蛋白培养基制备
1.3.1备料
配置酸性微量元素：称取和/或量取1.491gfecl2·4h2o、0.06gh3bo4、0.068gzncl2、0.1725gcucl2·7h2o、0.0635gmncl2、0.0119gcocl2·6h2o、0.0235gnicl2·6h2o和4.18mlhcl，溶于蒸馏水中，定容至100ml。
配置碱性微量元素：称取0.01729gna2seo3、0.0242gna2moo4·2h2o和0.4gnaoh，溶于蒸馏水中，定容至100ml。
配置维生素液：称取0.02g生物素、0.21g维生素b3、0.5g维生素b6、0.1g维生素b2、0.2g维生素b1、0.25g维生素b12和泛酸0.1g，溶于蒸馏水中，定容至100ml。
称取和/或量取1.1gcacl2、1.0gmgcl2、酸性微量元素1ml和碱性微量元素1ml，蒸馏水定容到100ml，高压125℃条件下灭菌30min制得1液，常温密封保存。
称取5.3gna2hpo4、3gnacl和4gkh2po4溶于蒸馏水中，定容至100ml，高压125℃30min，蒸馏水定容到100ml，高压125℃条件下灭菌30min制得2液，常温密封保存。
称取和/或量取2gnahco3和维生素液2ml，蒸馏水定容到100ml，0.22μm滤膜过滤制得3液，4℃密封保存。
称取2.5gna2s，蒸馏水定容到100ml，0.22μm滤膜过滤制得4液，4℃密封保存。
1.3.2配置培养基
称取2g琼脂于200ml蒸馏水中，高压125℃条件下灭菌30min后，立即在超净工作台中依次加入2ml的1液、2ml的2液、1ml的3液、2ml的4液及步骤1.1制得的纯化后的粘蛋白溶液30～40ml，每加入一种液体后需摇匀；倒入无菌平皿中，每个平皿20ml；待冷却凝固后置于无菌塑料袋内，4℃密封保存。
1.4细菌分离
1.4.1配置菌液
收集人类新鲜的粪便，取1g粪便加入9ml生理盐水混匀，以10倍的梯度进行连续稀释，取稀释度为10-6的粪便悬液1ml接种于9ml步骤1.2所制得的粘蛋白液体培养基中，于37℃厌氧培养4天取得菌液。
本实施例中所使用的人类粪便采集自健康志愿者。
1.4.2pcr扩增
以培养3天后的菌液作为模板，使用针对akkermansia属的引物进行pcr；其中，引物一的序列为cagcacgtgaaggtggggac，引物二的序列为ccttgcggttggcttcagat。挑选pcr反应阳性管中的菌液接种于步骤1.3所制得的粘蛋白固体培养基上厌氧培养出菌落。
1.4.3培养纯化菌落
将粘蛋白固体培养基上的菌落接种于巧克力平板上厌氧培养出菌落，将巧克力平板上的菌落接种于哥伦比亚血平板上进行纯化培养出菌落，取哥伦比亚血平板上的菌落通过16srna通用引物进行pcr测序验证。
为便于描述，本发明实施例中，得到的纯化菌落命名为norzea37。
实施例2
本实施例为验证实施例1所制得的纯化菌落参与碳水化合物代谢的具体实施例。
2.1dna提取、建库及测序
使用小鼠小剂量粪便dna提取试剂盒(美基生物，广州)，根据产品说明书以及本领域普通技术人员都熟知的技术手段进行细菌dna提取。
使用truseqdna样本制备试剂盒，根据产品说明书以及本领域普通技术人员都熟知的技术手段，构建双末端150bp、插入片段长度250-300bp的dna文库。
利用illuminahiseq2500测序仪进行dna测序，并提取出高质量的测序片段，进行细菌基因组组装、注释及比较基因组分析等后续工作。
2.2基因组组装
使用velvet微生物基因组组装软件对测序片段进行组装，组装过程中依次选择不同的kmer参数(35-145之间)，并从中选取最优的组装结果。
获得初步的contig组装结果后，使用sspace软件进行contig延长及scaffold构架，接着使用gapfiller对scaffold进行空位消除。最后过滤掉长度低于200bp的contig，并得到最终的组装结果。
2.3基因功能预测
使用prokka基因组分析软件进行基因注释，prokka使用一系列的预测工具来识别基因组的特征区域及其位置，包括：1)使用rnammer软件预测小rrna(如5s,16s和23srrna)；2)使用aragorn软件预测trna；及3)使用piler-cr预测crispr序列。prokka使用多个步骤来对蛋白编码基因进行功能注释：1)使用prodigal软件预测组装结果中的蛋白编码基因和假基因位点；2)与模式菌株atggbaa-835同源的蛋白编码基因则参考模式菌株的功能注释；3)其余的蛋白家族则在uniprot和refseq数据库中搜索细菌蛋白信息进行比对。
prokka运行完毕后，继续使用cog(美国国家生物信息中心ncbi提供的基因家族功能数据库)和kegg(京都基因和基因组百科全书)数据库来比对注释基因功能。比对要求的参数为：可比上的长度超过该基因长度的70％，且相似度高于35％。在以上几个数据库中找不到匹配的基因标记为假设蛋白。对碳水化合物水解酶的基因功能预测是用cazy(碳水化合物激活酶数据库)用同样的方法进行注释的。
根据基因功能预测结果，发现norzea37具有参与半乳糖代谢、果糖和甘露糖代谢、淀粉和蔗糖代谢的基因。因此，norzea37可参与碳水化合物的代谢。
实施例3
本实施例为验证实施例1所制得的纯化菌落参与脂肪物代谢的具体实施例。
3.1dna提取、建库及测序
使用小鼠小剂量粪便dna提取试剂盒(美基生物，广州)，根据产品说明书以及本领域普通技术人员都熟知的技术手段进行细菌dna提取。
使用truseqdna样本制备试剂盒，根据产品说明书以及本领域普通技术人员都熟知的技术手段，构建双末端150bp、插入片段长度250-300bp的dna文库。
利用illuminahiseq2500测序仪进行dna测序，并提取出高质量的测序片段，进行细菌基因组组装、注释及比较基因组分析等后续工作。
3.2基因组组装
使用velvet微生物基因组组装软件对测序片段进行组装，组装过程中依次选择不同的kmer参数(35-145之间)，并从中选取最优的组装结果。获得初步的contig组装结果后，使用sspace软件进行contig延长及scaffold构架，接着使用gapfiller对scaffold进行空位消除。最后过滤掉长度低于200bp的contig，并得到最终的组装结果。
3.3基因功能预测
使用prokka基因组分析软件进行基因注释，prokka使用一系列的预测工具来识别基因组的特征区域及其位置，包括：1)使用rnammer软件预测小rrna(如5s,16s和23srrna)；2)使用aragorn软件预测trna；及3)使用piler-cr预测crispr序列。prokka使用多个步骤来对蛋白编码基因进行功能注释：1)使用prodigal软件预测组装结果中的蛋白编码基因和假基因位点；2)与模式菌株atggbaa-835同源的蛋白编码基因则参考模式菌株的功能注释；3)其余的蛋白家族则在uniprot和refseq数据库中搜索细菌蛋白信息进行比对。
prokka运行完毕后，继续使用cog(美国国家生物信息中心ncbi提供的基因家族功能数据库)和kegg(京都基因和基因组百科全书)数据库来比对注释基因功能。比对要求的参数为：可比上的长度超过该基因长度的70％，且相似度高于35％。在以上几个数据库中找不到匹配的基因标记为假设蛋白。对碳水化合物水解酶的基因功能预测是用cazy(碳水化合物激活酶数据库)用同样的方法进行注释的。
根据基因功能预测结果，发现norzea37具有参与脂肪酸代谢、甘油酯代谢、甘油磷脂及鞘脂代谢的基因。因此，norzea37可参与脂类的代谢。
实施例4
本实施例为验证实施例1所制得的纯化菌落可产生维生素的具体实施例。
4.1dna提取、建库及测序
使用小鼠小剂量粪便dna提取试剂盒(美基生物，广州)，根据产品说明书以及本领域普通技术人员都熟知的技术手段进行细菌dna提取。
使用truseqdna样本制备试剂盒，根据产品说明书以及本领域普通技术人员都熟知的技术手段，构建双末端150bp、插入片段长度250-300bp的dna文库。
利用illuminahiseq2500测序仪进行dna测序，并提取出高质量的测序片段，进行细菌基因组组装、注释及比较基因组分析等后续工作。
4.2基因组组装
使用velvet微生物基因组组装软件对测序片段进行组装，组装过程中依次选择不同的kmer参数(35-145之间)，并从中选取最优的组装结果。
获得初步的contig组装结果后，使用sspace软件进行contig延长及scaffold构架，接着使用gapfiller对scaffold进行空位消除。最后过滤掉长度低于200bp的contig，并得到最终的组装结果。
4.3基因功能预测
使用prokka基因组分析软件进行基因注释，prokka使用一系列的预测工具来识别基因组的特征区域及其位置，包括：1)使用rnammer软件预测小rrna(如5s,16s和23srrna)；2)使用aragorn软件预测trna；及3)使用piler-cr预测crispr序列。prokka使用多个步骤来对蛋白编码基因进行功能注释：1)使用prodigal软件预测组装结果中的蛋白编码基因和假基因位点；2)与模式菌株atggbaa-835同源的蛋白编码基因则参考模式菌株的功能注释；3)其余的蛋白家族则在uniprot和refseq数据库中搜索细菌蛋白信息进行比对。
prokka运行完毕后，继续使用cog(美国国家生物信息中心ncbi提供的基因家族功能数据库)和kegg(京都基因和基因组百科全书)数据库来比对注释基因功能。比对要求的参数为：可比上的长度超过该基因长度的70％，且相似度高于35％。在以上几个数据库中找不到匹配的基因标记为假设蛋白。对碳水化合物水解酶的基因功能预测是用cazy(碳水化合物激活酶数据库)用同样的方法进行注释的。
基因功能预测发现norzea37具有参与维生素b1(硫胺素)、维生素b2(核黄素)、维生素b3(烟酸)、维生素b5(泛酸)、维生素b6、维生素b7(生物素)及维生素b9(叶酸合成的基因。因此，norzea37可参与维生素的合成。
实施例5
本实施例为验证实施例1所制得的纯化菌落可产生短链脂肪酸乙酸的具体实施例。
5.1dna提取、建库及测序
使用小鼠小剂量粪便dna提取试剂盒(美基生物，广州)，根据产品说明书以及本领域普通技术人员都熟知的技术手段进行细菌dna提取。
使用truseqdna样本制备试剂盒，根据产品说明书以及本领域普通技术人员都熟知的技术手段，构建双末端150bp、插入片段长度250-300bp的dna文库。
利用illuminahiseq2500测序仪进行dna测序，并提取出高质量的测序片段，进行细菌基因组组装、注释及比较基因组分析等后续工作。
5.2基因组组装
使用velvet微生物基因组组装软件对测序片段进行组装，组装过程中依次选择不同的kmer参数(35-145之间)，并从中选取最优的组装结果。
获得初步的contig组装结果后，使用sspace软件进行contig延长及scaffold构架，接着使用gapfiller对scaffold进行空位消除。最后过滤掉长度低于200bp的contig，并得到最终的组装结果。
5.3基因功能预测
使用prokka基因组分析软件进行基因注释，prokka使用一系列的预测工具来识别基因组的特征区域及其位置，包括：1)使用rnammer软件预测小rrna(如5s,16s和23srrna)；2)使用aragorn软件预测trna；及3)使用piler-cr预测crispr序列。prokka使用多个步骤来对蛋白编码基因进行功能注释：1)使用prodigal软件预测组装结果中的蛋白编码基因和假基因位点；2)与模式菌株atggbaa-835同源的蛋白编码基因则参考模式菌株的功能注释；3)其余的蛋白家族则在uniprot和refseq数据库中搜索细菌蛋白信息进行比对。
prokka运行完毕后，继续使用cog(美国国家生物信息中心ncbi提供的基因家族功能数据库)和kegg(京都基因和基因组百科全书)数据库来比对注释基因功能。比对要求的参数为：可比上的长度超过该基因长度的70％，且相似度高于35％。在以上几个数据库中找不到匹配的基因标记为假设蛋白。对碳水化合物水解酶的基因功能预测是用cazy(碳水化合物激活酶数据库)用同样的方法进行注释的。
基因功能预测发现norzea37具有参与乙酸合成的基因。因此，norzea37可参与短链脂肪酸的合成。
5.4气相色谱法鉴定细菌代谢产物中的短链脂肪酸
把105cfunorzea37接种于500ml的粘蛋白液体培养基中，每升去离子水中含有1g粘蛋白、37g猪脑心浸液和5mg的l-盐酸半胱氨酸，置于厌氧培养箱中培养87小时。
收取培养上清进行以下处理：称取培养基样品约180～200mg置于2ml的ep管中，加入1ml蒸馏水混悬样品。再涡旋震荡10min成匀浆，然后4℃下离心(5000×g)10min，取上清过0.22μm滤膜，向上清液中加入1/10体积的50％硫酸，摇匀1min。再加入2倍体积的乙醚轻轻混匀(勿涡旋)萃取20min，后4℃下离心(1000×g)5min，取上层清液待分析。使用agilent7890气相色谱仪进行检测
具体的检测参数为，色谱柱的规格：db-ffap，柱长30m，内径0.32mm，膜厚0.25um，进样口温度230℃，检测器温度250℃，分流比10:1。程序升温的具体方法为：100℃保持0.5min，以8℃/min升至170℃并维持0.5min。最后以20℃/min升至220℃并维持2min。
实验所得细菌菌落代谢产物中的短链脂肪酸含量可参阅图1。
从实施例2～实施例5可以得出，本发明提供的技术方案所制得的细菌，可参与碳水化合物代谢以及脂肪代谢，同时还可以产生维生素和短链脂肪酸乙酸，进一步地推定，本发明制得的细菌，是一种具有减肥以及抗氧化功能的益生菌。
综上所述，本发明提供了一种益生菌，所述益生菌的保藏编号为：gdmcc60085。本发明还提供了一种上述益生菌的制备方法，所述制备方法为：步骤一、配置菌液；步骤二、pcr扩增：步骤三、培养纯化菌落。本发明还提供了一种益生菌固态曲，所述益生菌固态曲由上述益生菌制得。本发明提供的技术方案中，经全基因测序实验，所制得的菌种可参与碳水化合物代谢以及脂肪代谢，同时还可以产生维生素和短链脂肪酸乙酸，是一种具有良好潜力的益生菌。同时，本发明提供的制备方法简单易操作，适合大规模推广应用。解决了现有技术中，益生菌种类单一、分离复杂的技术缺陷。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。