一种从藻体表面去除多糖和外源微生物的方法与流程

本发明涉及一种从藻体表面去除多糖和外源微生物的方法，属于藻体分离领域。
背景技术：
：藻体和微生物之间存在密切关系，微生物不仅附着在藻体的表面，还寄身于藻体的细胞内部。对于具有粘附性的外源微生物，藻类的表面为其生活和附着提供了生存条件，藻类分泌的糖类、脂类等代谢产物又能被细菌吸收利用，给细菌的生存提供营养。藻体脱落的部分也可以被外源微生物降解。反之，外源微生物能够产生一些胞外产物，如生长因子、维生素等，为藻类的生长发育做出贡献。因此，藻类与外生细菌之间既相互利用又拮抗，二者通过相互作用进行双向选择。关于藻体和细菌之间的复杂关系，目前研究的主要方向有(a)藻类与藻际环境中微生物的相互关系：miranda等人在2013年的一篇研究中做了全面的研究并提出一个猜想：微生物产生藻类，以紫菜属物种为研究对象，并推测和紫菜共存的一些细菌可能对于维持其形态结构和一些营养物质的生成存在不可或缺的作用。同时也有研究学者发现在绿藻和褐藻中也存在外源微生物影响藻体形态的现象。(b)藻类附生菌所产生的生物活性物质：许多学者致力于藻体附着外源微生物活性物质如毒素、抑菌物质和抗生素等等。（c）藻类附生菌的种群组成：为了研究藻类附生种群的类型，利用平板分离和16s扩增鉴定种群多样性（4）无菌藻种的获得：通过添加抗生素来抑制外源微生物的生长而获得无菌材料，或者是通过反复冲洗获得无菌材料。随着测序技术的发展，基因组学的研究逐渐成为热门领域，然而对于海洋生物来说，外源微生物的存在成为制约其基因组学发展的一大障碍。许多学者致力于藻类无菌化的培养，然而比较成功的技术手段尚未见到相关报道。在藻类无外源微生物dna污染的高质量dna制备过程中，仍然存在很大的问题：1、目前的研究来看，藻类的dna样本是一个高度复杂的样本，即提取的dna中存在藻体本身的dna同时也存在大量外源微生物的dna，在基因组的拼接组装过程中很难利用生物信息学技术将外源微生物的dna片段彻底去除，因此会影响基因组拼接组装的准确性，从而影响后续基因组特性的分析；2、藻类无菌材料的获得和维持是非常困难的，即使加入抗生素，也很难去除所含的细菌，推测某些细菌为其内共生微生物。现有技术中对于无菌藻株的获得和维持仍然存在很大的问题。例如在利用抗生素抑制外源微生物的污染，有的物种长期加入抗生素就会产生抗性或者是不同的物种需要添加不同的抗生素类型。即使获得无菌的藻株，在无菌培养的过程中也很难维持。也有研究者利用超声波的方法反复冲洗样品，但这个技术的可重复性和操作性比较差。即使是除菌效果的检测，单纯的依靠平板培养也是不可靠的，因为90%的细菌是不可培养的。因此在目前藻类基因组项目的实施过程中，我们可以看到，一些学者是加入抗生素处理，而更多的是在获得基因组信息以后，从序列入手，包括和已有的外源微生物进行比对，根据相似性去除外源微生物的序列。或者是根据测序的覆盖度来剔除外源微生物的序列。这两种技术手段都存在弊端，有可能剔除不干净或者是将自己本身的基因组序列剔除掉。因此，在进行项目之前，就应该寻找一种从材料上解决外源微生物污染的方法。技术实现要素：为了克服上述现有技术的不足，本发明一种从藻体表面脱除多糖和外源微生物的方法，该方法结合藻类的特性，探索出一种降低藻类外源微生物污染的方法，其主要包括振荡前准备预处理、机械振荡、藻体孵育三个步骤，其不仅可以去除粘附在藻体表面的多糖，而且可以有效防止藻体表面附着的外源微生物的污染。总之，通过机械振荡的方法，可以有效的解决丛藻类表面多糖和细菌的问题，促进藻类基因组工作的开展。本发明通过下述技术方案实现上述技术效果：一种从藻体表面脱除多糖和外源微生物的方法，其具体包括下述步骤：1）振荡前准备：向研磨管内加入孔径为25-50目的石英砂0.05-0.15质量份，钢珠0.05-0.15质量份、玻璃珠0.05-0.15份，然后在再向研磨管中加入0.1质量份的藻体，向其中加入1体积份的无菌海水，混合均匀得到振荡材料；2）机械振荡：将载有藻体的振荡材料在振荡仪上进行机械振荡，控制振荡转速在5000-6000rpm之间，振荡时间为5-30s；3）藻体孵育：振荡完成后将材料取出置于0.05%吐温80缓冲液中孵育4-8min，使用无菌海水进行冲洗3-4次，然后将藻体置于无菌海水中，使用纱布过滤去除藻体表面的粘液，即可得到脱除多糖和外源微生物的藻体。上述所述的从藻体表面脱除多糖和外源微生物的方法中，所述步骤1中的振荡材料中包括25-50目的石英砂0.1质量份，钢珠0.1质量份、玻璃珠0.1份。上述所述的从藻体表面脱除多糖和外源微生物的方法中，所述藻体孵育步骤中材料在0.05%吐温80缓冲液中孵育时间为5min。上述所述的从藻体表面脱除多糖和外源微生物的方法中，所述步骤2中的振荡速度为6500rpm，振荡时间为20s。藻体在经过不同介质和强度的振荡以后，由于藻体收到巨大的机械力很有可能造成细胞破裂，综合藻体损失率、藻细胞成活率以及多糖及微生物的去除率可以发现，本发明实施例1对应的藻体损失率最低，藻细胞成活率以及多糖及微生物的去除率最高，为本发明的最佳实施例，即本发明所述工艺的最佳处理条件为：步骤1中的振荡材料中包括25-50目的石英砂0.1质量份，钢珠0.1质量份、玻璃珠0.1份；藻体孵育步骤中材料在0.05%吐温80缓冲液中孵育时间为5min；步骤2中的振荡速度为6500rpm，振荡时间为20s。本发明所述的从藻体表面脱除多糖和外源微生物的方法不仅可以去除粘附在藻体表面的多糖，而且可以有效防止藻体表面附着的外源微生物的污染。总之，通过机械振荡的方法，可以有效的解决丛藻类表面多糖和细菌的问题，促进藻类基因组工作的开展。附图说明图1为处理前后藻体表面附着细菌的扫描电镜检测情况，左图为处理之前，右图为处理之后,。图2外源微生物去除之前藻体dna中gc含量与contig深度分布图。图3为外源微生物去除之后藻体dna中gc含量与contig深度分布图。具体实施方式以下通过具体实施例进一步描述本发明，但所述领域技术人员应能理解，所述实施例并不以任何方式限定本发明专利保护的范围。实施例1本发明从藻体表面脱除多糖和外源微生物的方法一种从藻体表面脱除多糖和外源微生物的方法，其具体包括如下步骤：1）振荡前准备：称取孔径25-50目的0.1g石英砂、0.1g的钢珠、0.1g的玻璃珠加进研磨管；然后称取0.1g藻体加进研磨管，加入1ml无菌海水；2）机械振荡：以上加入不同研磨介质的材料通过不同的振荡强度和时间进行机械振荡，转速为500rpm的转速，振荡时间20s；振荡完成以后，将材料从研磨管中取出放在培养皿中；3）藻体孵育：振荡完成后将材料取出置于0.05%吐温80缓冲液中孵育5min，使用无菌海水进行冲洗3-4次，然后将藻体置于无菌海水中，使用纱布过滤去除藻体表面的粘液，即可得到脱除多糖和外源微生物的藻体。藻体在经过不同介质和强度的振荡以后，由于藻体收到巨大的机械力，很有可能会造成细胞破裂，因此把藻体拿出来以后放在在0.05%吐温80缓冲液中孵育以保持细胞的渗透压稳定，从而维持细胞的活性；进行后续实验之前，应该把藻体拿出来在比重为1.030的海水中初步冲洗3次，去除缓冲液的影响。研磨完以后的材料，可观察到无菌海水的表面形成了一层粘液，这就表明已经将藻体表面的多糖已经剥离下来，同时也会将附着的细菌剥离下来。为了进一步分开藻体和剥离下来的表面多糖，用灭菌海水在烧杯中充分冲洗材料，然后用纱布过滤去除，将藻体叶片留在纱布上，含有多糖和细菌的溶液被过滤掉，通过多次的反复冲洗和过滤，将藻体的剥离多糖（含细菌）彻底出去。为了验证本发明处理工艺对于表面附着多糖和微生物的处理效果，对处理前后的藻体表面的细菌和微生物进行了验证。1.处理前后藻体表面附着细菌的扫描电镜检测图1为处理前后藻体表面附着细菌的扫描电镜检测情况（左图为处理之前，右图为处理之后）。扫描电镜观察结果显示，除菌之前藻体的表面会由于多糖的存在，附生细菌聚集在藻体表面形成一层菌膜。这些附着细菌在经历扫描电镜样品的制备过程中的多次清洗，也很难去除，因此证明这些细菌是牢固粘附在藻体的表面，如果用这样的材料去进行藻类基因组的研究，势必会影响研究结果的准确性。结扫描电镜观察结果显示，藻体的表面由于振荡作用和反复冲洗，藻体表面的菌膜已经被全部剥离，只有藻体本身的细胞表面结构，说明藻体表面的细菌已经得到很好的去除。2.利用高通量测序技术鉴定未处理前后藻体总dna成分鉴定为了进一步验证外源微生物处理前后dna的复杂成分，我们采用ctab法提取基因组dna（未处理的材料），构建了基因组文库，并进行高通量测序工作，图2外源微生物去除之前藻体dna中gc含量与contig深度分布图。从k-mer分布图可以看出，k-mer个数与深度关系分布图异常，自左向右出现多了峰图。初步推断该藻类样品可能存在严重的外源微生物污染。构建contig覆盖度及gc含量的分布图，结果显示gc含量分布在20-80%之间，不符合该物种gc分布的特征；contig覆盖度分为1-55,56-399，及400-600三个不同的区域，也是出现分布不集中的现象。将这三个不同的区域的contig与现有的ncbinucleotidedatabases数据库进行blast比对，结果显示：覆盖度在1-55区间及400-600区间内的contig主要比对到海洋菌类（roseobacter，ruegeria,erythrobacter等）。覆盖度在55-399区间内的contig，主要比对到藻类序列以及两种少量的海洋菌类(roseobacter，lacinutrix)。进一步证明了藻类dna成分的复杂性。经过机械振荡以后同样提取了总dna，进行高通量测序。图3为外源微生物去除之后藻体dna中gc含量与contig深度分布图。结果显示：contig深度和gc含量分布图比较集中，证明dna的成分比较单一。且经过和数据库的比对，细菌的比例极低。说明通过本实验达到了降低藻类外源微生物污染的效果，样品可以满足下一步基因组工作的需求。实施例2-实施例8本发明从藻体表面脱除多糖和外源微生物的方法申请人发现，藻体在经过不同介质和强度的振荡以后，由于藻体收到巨大的机械力，很有可能会造成细胞破裂，这显著影响着后续实验的实验效果，为此有必要对本发明的工艺进行进一步优化。表1实施例2-实施例8所述处理工艺表2本发明所述方法对去除效果和藻体细胞成活率的影响藻体损失率（%）细胞成活率（%）多糖去除率（%）微生物去除率（%）实施例15.3195.398.799.4实施例28.6290.194.596.7实施例310.2686.793.698.1实施例48.1488.694.797.6实施例56.2392.495.396.3实施例69.1891.896.895.8实施例77.2490.497.896.9实施例85.8488.998.695.2由表2所述的处理结果来看，实施例1对应的藻体损失率最低，藻细胞成活率以及多糖及微生物的去除率最高，为本发明的最佳实施例，即本发明所述工艺的最佳处理条件为：步骤1中的振荡材料中包括25-50目的石英砂0.1质量份，钢珠0.1质量份、玻璃珠0.1份；藻体孵育步骤中材料在0.05%吐温80缓冲液中孵育时间为5min；步骤2中的振荡速度为6500rpm，振荡时间为20s。当前第1页12