1.一种畜禽源大肠杆菌β-内酰胺类药物耐药基因多重PCR检测试剂盒,其特征在于:含有PCR模板制备试剂和耐药基因多重PCR扩增试剂,所述PCR模板制备试剂是由样品洗涤液25mL~50mL和处理液2.5mL~5.0mL组成,所述耐药基因多重PCR扩增试剂包括2×TaqPCR MasterMix 650μL~1300μL,耐药基因CTX-M基因、TEM基因、SHV基因的特异性引物400μL~800μL,灭菌双蒸水1mL~2mL和阴性对照100μL~200μL、阳性对照100μL~200μL。
2.根据权利要求1所述的一种畜禽源大肠杆菌β-内酰胺类药物耐药基因多重PCR检测试剂盒,其特征在于:所述的耐药基因即CTX-M基因、TEM基因、SHV基因的特异性上下游引物序列如下:
CTX-M:For:5-AAGGCGTTTTGACAGACTATTCAT-3;
Rev:5-CCGTTTCCGCTATTACAAACC-3;
TEM:For:5-TGAGTATTCAACATTTCCGTGTCG-3;
Rev:5-TTACCAATGCTTAATCAGTGAGGC-3;
SHV:For:5-TGACGGTCGGCGAACTCT-3;
Rev:5-GGGTATCCCGCAGATAAATCAC-3。
3.如权利要求1或2所述的一种畜禽源大肠杆菌β-内酰胺类药物耐药基因多重PCR检测试剂盒的使用方法,其特征在于:包括以下步骤:
PCR模板的制备方法:
(1)普通培养基摇瓶培养增菌;
(2)取经3-6h培养的菌液于无菌EP管中,离心,弃上清,再加入PCR模板制备试剂洗涤液,重复离心一次,弃上清,最后加入PCR模板制备试剂样品处理液,震荡混匀后备用;
畜禽大肠杆菌β-内酰胺类药物耐药基因多重PCR检测技术中试剂的组成:
(1)取2xTaqPCR MasterMix、耐药基因引物于无菌PCR反应薄壁管中。
(2)加入已制备好模板,用灭菌双蒸水补至50μL即可;
PCR扩增参数为:
(1)95℃预变性5min;
(2)95℃变性55s、59℃退火50s、72℃延伸55s,共35个循环,
(3)72℃延伸7min,取出至4℃保存备用;
耐药基因检测结果判定:取PCR产物,于1.2%琼脂糖凝胶中电泳,100V电压,电泳30min,于凝胶成像仪下拍照判定结果,其中450bp、860bp、950bp的条带分别指示SHV基因、TEM基因、CTX-M基因。