本发明涉及大肠杆菌β-内酰胺类药物耐药基因多重PCR检测技术，属于医学分子生物学领域，具体是关于畜禽大肠杆菌β-内酰胺类药物耐药基因多重PCR检测技术方法及其在畜禽大肠杆菌耐药性检测中的应用。
背景技术：
：β-内酰胺类药物是指化学结构中具有β-内酰胺环的一大类药物，包括青霉素、头孢菌素、头霉素、单环β-内酰胺类、β-内酰胺酶阻滞剂以及碳青霉烯类药物。各种β-内酰胺类抗生素的作用机制均相似，都能抑制胞壁粘肽合成酶，从而阻碍细胞壁粘肽合成，使细菌胞壁缺损，菌体膨胀裂解。β-内酰胺类抗生素是目前临床抗感染治疗最普遍应用的一类抗生素，随着这类抗生素的广泛使用和致病菌的变迁，产生了细菌对这类抗生素的耐药性问题，细菌产生超广谱β-内酰胺酶是大部分细菌耐药的原因之一。根据氨基酸序列的同源性，β-内酰胺酶可分为不同基因型。目前可分为TEM、SHV、CTX-M、OXA等基因型，其中以TEM和SHV两种基因型最多，呈世界性分布，不同地区的基因型有差异。例如：美国主要流行TEM和SHV型；阿根廷以CTX-M型为主；西班牙以CTX-M-10为主，其次是SHV-2和TEM-4；希腊以SHV-5为主，其次是CTX-M型；我国主要流行TEM、SHV、CTX-M型。本专利在以畜禽大肠杆菌分子流行病学调查的基础上，建立了TEM、SHV、CTX-M型β-内酰胺酶耐药基因多重PCR检测方法。传统的细菌耐药性检测方法主要有常规药敏试验、抗性蛋白检测方法和耐药性分子检测方法等。这些方法的特点是易操作、成本低，药物可灵活选择，缺点是操作繁琐、经验依赖性强、报告结果慢。因为抗菌药物的广泛使用及耐药基因的多样性、复杂性，单一临床病原菌经常含有多个耐药基因，为了提高检测的准确性和特异性，需要对多种耐药基因进行检测。技术实现要素：本发明要解决的技术问题在于，提供一种快速检测畜禽大肠杆菌β-内酰胺类药物耐药基因的三重PCR检测试剂盒及其特异性引物、使用方法，能显著提高畜禽大肠杆菌β-内酰胺类药物耐药性的检测灵敏度和检测效率，降低检测成本，以克服现有技术存在的成本高、耗时长等诸多不足。本发明的技术内容：一种畜禽源大肠杆菌β-内酰胺类药物耐药基因多重PCR检测试剂盒，含有PCR模板制备试剂和耐药基因多重PCR扩增试剂，所述PCR模板制备试剂是由样品洗涤液25mL～50mL和处理液2.5mL～5.0mL组成，所述耐药基因多重PCR扩增试剂包括2×TaqPCRMasterMix650μL～1300μL，耐药基因CTX-M基因、TEM基因、SHV基因的特异性引物400μL～800μL，灭菌双蒸水1mL～2mL和阴性对照100μL～200μL、阳性对照100μL～200μL。所述耐药基因即CTX-M基因、TEM基因、SHV基因的特异性上下游引物序列如下：CTX-M：For：5-AAGGCGTTTTGACAGACTATTCAT-3；Rev-1：5-CCGTTTCCGCTATTACAAACC-3；TEM：For：5-TGAGTATTCAACATTTCCGTGTCG-3；Rev-2：5-TTACCAATGCTTAATCAGTGAGGC-3；SHV：For：5-TGACGGTCGGCGAACTCT-3；Rev-3：5-GGGTATCCCGCAGATAAATCAC-3。本发明所述试剂盒使用方法包括以下步骤：PCR模板的制备方法：(1)普通培养基摇瓶培养增菌；(2)取1mL经3-6h培养的菌液于无菌1.5mLEP管中，8000r/min离心3分钟，弃上清，再加入1mLPCR模板制备试剂洗涤液，重复离心一次，弃上清，最后加入100μLPCR模板制备试剂样品处理液，震荡混匀后备用。畜禽大肠杆菌β-内酰胺类药物耐药基因多重PCR检测技术中试剂的组成：(1)取2xTaqPCRMasterMix25μL、耐药基因引物2.9μL于无菌PCR反应薄壁管中。(2)加入已制备好模板2μL，用灭菌双蒸水补至50μL即可；PCR扩增参数为：(1)95℃预变性5min；(2)95℃变性55s、59℃退火50s、72℃延伸55s，共35个循环，(3)72℃延伸7min，取出至4℃保存备用；耐药基因检测结果判定:取8μLPCR产物，于1.2％琼脂糖凝胶中电泳，100V电压，电泳30min，于凝胶成像仪下拍照判定结果，其中450bp、860bp、950bp的条带分别指示SHV基因、TEM基因、CTX-M基因。本发明有益效果：本发明将显著提高畜禽大肠杆菌β-内酰胺类药物耐药基因的检测效率；本发明所建立试剂盒适用于检测畜禽源致病大肠杆菌β-内酰胺类药物耐药性，能实现临床病例和产品污染程度的快速评价，为该类疾病的防控提供技术支持与理论依据，并为动物性食品安全检测提供可靠技术。本发明与现有技术相比，具有以下技术效果和特点：(1)便捷性好：本发明以PCR为技术基础，相比传统病原分离鉴定、药物敏感试验，不仅能提高检测效率，还降低了检测成本，缩短了检测时间，该多重方法将检测时间从数天缩短至1天内完成。(2)特异性好：本发明应用分子生物学技术，针对特定基因设计引物，保证检测结果的特异性。(3)敏感性高：本发明基于PCR技术建立的PCR试剂盒，可检测病原核酸量最低至1.0×103copies/μL。本发明所提供的多重PCR技术正满足了对多种耐药基因进行检测的需求，并具有敏感、特异、快速等优点，可以对微量目的基因进行检测，具有灵敏高效的特点。本发明设计了3对特异性引物，构建多重PCR反应体系，以达到快速检测β-内酰胺类耐药基因的目的，多重PCR技术最有研究前景和应用价值。附图说明图1为本发明畜禽源大肠杆菌β-内酰胺类药物耐药基因多重PCR检测试剂盒的制备流程图。具体实施方式本发明所述畜禽源大肠杆菌β-内酰胺类药物耐药基因多重PCR检测试剂盒含有PCR模板制备试剂和耐药基因多重PCR扩增试剂，其特征在于：所述PCR模板制备试剂是由样品洗涤液25mL～50mL和处理液2.5mL～5.0mL组成，所述耐药基因多重PCR扩增试剂包括2×TaqPCRMasterMix650μL～1300μL，耐药基因CTX-M基因、TEM基因、SHV基因的特异性引物400μL～800μL，灭菌双蒸水1mL～2mL和阴性对照100μL～200μL、阳性对照100μL～200μL。所述三种耐药基因即CTX-M基因、TEM基因、SHV基因的特异性上下游引物序列如下：CTX-M：For：5-AAGGCGTTTTGACAGACTATTCAT-3Rev-1：5-CCGTTTCCGCTATTACAAACC-3TEM：For：5-TGAGTATTCAACATTTCCGTGTCG-3Rev-2：5-TTACCAATGCTTAATCAGTGAGGC-3SHV：For：5-TGACGGTCGGCGAACTCT-3Rev-3：5-GGGTATCCCGCAGATAAATCAC-3本发明所述试剂盒使用方法包括以下步骤：PCR模板的制备方法：(1)普通培养基摇瓶培养增菌；(2)取1mL经3-6h培养的菌液于无菌1.5mLEP管中，8000r/min离心3分钟，弃上清，再加入1mLPCR模板制备试剂洗涤液，重复离心一次，弃上清，最后加入100μLPCR模板制备试剂样品处理液，震荡混匀后备用。畜禽大肠杆菌β-内酰胺类药物耐药基因多重PCR检测技术中试剂的组成：(1)取2xTaqPCRMasterMix25μL、耐药基因引物2.9μL于无菌PCR反应薄壁管中。(2)加入已制备好模板2μL，用灭菌双蒸水补至50μL即可。PCR扩增参数为：(1)95℃预变性5min；(2)95℃变性55s、59℃退火50s、72℃延伸55s，共33个循环，(3)72℃延伸7min，取出至4℃保存备用。耐药基因检测结果判定:取8μLPCR产物，于1.2％琼脂糖凝胶电泳中，100V电压，电泳30min，于凝胶成像仪下拍照判定结果，450bp、860bp、950bp的条带分别指示SHV基因、TEM基因、CTX-M基因。详细示例：1、配制反应液(1)配制引物混合液A.设计并合成引物针对大肠杆菌β-内酰胺类药物耐药基因CTX-M基因、TEM基因、SHV基因，用软件PrimerPremier5.0分别设计一对特异性引物，并合成引物。B.制备引物混合液将三对引物稀释至浓度10μmol/L后，各取100μL，混匀。(2)多重PCR反应缓冲液取适量TaqPolymerase、dNTPeach、Tris-HCl(pH8.3)、KCl、MgCl2储备液溶于500μL双蒸水，使TaqPolymerase终浓度为0.1U/μl、dNTPeach终浓度为500μmol/L、Tris-HCl(pH8.3)终浓度为20mmol/L、KCl终浓度为100mmol/L、MgCl2终浓度为3mmol/L。于-20℃备用。2、制备阴/阳性对照(1)制备阳性对照取普通营养琼脂培养基中大肠杆菌β-内酰胺类药物3种耐药株单个菌落分别接种于普通营养液体培养基中培养24h的培养液1.5mL以4℃10000r/min离心1min，弃上清，提取3种大肠杆菌耐药菌株基因组DNA。(2)制备阴性对照以灭菌超纯水为阴性对照。3、检测过程(1)反应体系取无菌PCR反应管，按表1所示依次加入所需试剂；表1试剂添加及用量试剂及添加量阳性对照阴性对照待检样本反应缓冲液25μL25μL25μL引物混合液2.9μL2.9μL2.9μL阳性对照3μL00阴性对照03μL0待检样本001μL～3μL灭菌超纯水补足50μL补足50μL补足50μL(2)反应程序将PCR反应管混匀瞬时离心后，加入20μL灭菌液体石蜡覆于液面上，并置PCR反应管于PCR扩增仪中，以95℃预变性5min；95℃变性55s、59℃退火50s、72℃延伸55s，共35个循环；72℃延伸7min，取出至4℃保存备用。(3)结果判定取8μL扩增产物以1.2％琼脂糖凝胶电泳检测结果，结果判定：阳性对照应出现清晰的目的条带，阴性对照无任何条带出现；若待检扩增模板出现与阳性对照相同条带，则判定待检样本阳性，若无任何条带出现则判定待检样本阴性。根据耐药基因片段大小与所示阳性对照基因一致性，判定是存在哪种耐药基因。当前第1页1 2 3