基于眼肌面积为首选性状的肉牛早期选种方法与流程

本发明涉及肉牛育种方法技术领域，特别涉及一种肉牛种牛的早期选择技术，尤指一种基于眼肌面积为首选性状的肉牛早期选种方法。

背景技术：

肉牛种公牛的选择对改良和提高整个牛群的质量尤为重要，种公牛的好坏代表将来牛群的发展方向与质量。传统的早期选种方案主要是根据其父母的遗传品质和个体本身发育情况两方面分阶段而定。父母的遗传品质主要是通过系谱档案及生产记录来进行评定。个体发育情况主要是评价外貌特征、体重体尺与品种标准的符合度以及后裔表现等。整个选种工作繁琐而且周期漫长。常用肉牛的选择方法，主要包括单项选择法、独立淘汰法和指数选择法等3种方法。

(一)单项选择法是指逐一选择所要改良的性状，即当第一个性状经选择达到育种目标后，再选择第二个性状，以此类推地选择下去直到全部性状都得到改良。这种方法简单易行，而且就某一性状而言，其选择效果很好。主要缺点是，当一次选择一个性状时，同时期其他性状较差的牛仍会呆在群内，影响整个牛群质量。

(二)独立淘汰法是指同时选择几个性状，分别规定最低标准，只要有一个性状不够标准，即予淘汰。此法简单易行，能收到全面提高选择效果的作用。但这种方法选择的结果，容易将一些只有个别性状没有达到标准，而其他方面都优秀的个体淘汰，而选留下来的往往是各个性状都表现中等的个体。此法缺点是对各个性状在经济上的重要性以及遗传力的高低都没有给予考虑。

(三)指数选择法

指数选择法是根据综合选择指数进行选择。该法运用了数量遗传学原理，将要选择的若干性状的表型值，根据它们各自的遗传力、经济上重要程度及性状间的表型相关和遗传相关给予不同的加权值，而制订出的一个可以使个体间相互比较的数值。缺点是需要大量的数据及各世代的性能记录来技术，数据的产生周期比较长。

随着人们对牛肉产品的需求骤增，对牛的生产性能要求越来越高，进而导致对肉牛种源的迫切需求，传统的种牛选择方法需要牛成年以后，对外貌、体型、精液品质等各项指标检测以后，甚至要通过对子代的评定(后裔测定)才能对种牛进行详细的评价，在时间、工作繁琐程度等方面限制了种牛的选择效率。因此，迫切需要一种快速、有效的种牛选择方法来加速种牛的选择过程，提高选种的准确率。

肉牛体尺、体重测定是反应肉牛表型特征的一个直观的指标，直接反应了肉牛本身的发育状况。肉牛线性评分时发现体尺受品种、性别及年龄的影响较大，只反映了牛的体型及结构情况，并不能很好的说明肉牛的肌肉发育状况，肉牛线性体型特征，如髻甲、肩部、腰宽、膘厚、大腿肌及民形状的评分，是对肌肉度的直观评定，能较客观的说明牛种的肌肉发育情况，而且肌肉度评分性状在品种间的差异极显著，而受性别的相对小一些，受年龄的影响更小，因此线性体型评分中的肌肉度评分较体尺测定性状更能说明肉牛的肌肉发育情况，在无法进行屠宰的情况下，可利用线性评分方法进行评估。

王淑辉等(2008)为了对肉牛进行早期选择并适时屠宰，该文通过超声波活体检测技术获得6种国内常用肉牛杂交品种和本土品种(60头)8月龄、22月龄眼肌面积和背膘厚数据，集中育肥屠宰后，用50头幼龄牛和成年牛超声测定的眼肌面积、背膘厚及体重建立了成年牛宰后性状(眼肌面积、背膘厚、产肉性状(高档肉质量、后部肉质量、优质肉质量和胴体质量))的数学预测模型，并对加入体重资料前后的预测模型进行检验分析。结果表明，屠宰后眼肌面积、背膘厚预测模型的决定系数小于0.75，但产肉性状预测模型的决定系数均大于0.75，经10头牛数据验证，所有模型预测结果与实测结果无显著差异，说明利用超声波技术测得幼龄牛或成年牛的眼肌面积和背膘厚预测屠宰后眼肌面积、背膘厚和产肉性状是可行的。传统的选种过程中父母的遗传品质主要是通过系谱档案及生产记录来进行评定。随着基因标记的广泛研究与应用，其在种牛遗传评价中发挥了不可替代的积极作用。分子标记技术已成为21世纪牛遗传改良的重要手段和方法，特别是良种选育，标记辅助选择可以在肉牛的生命早期开始，不必等生产性能完全表现出来就对生产性状进行评价，预测后期种用价值。可以在两性中同时选择任何生产性状，突破了限性性状只能从单种性状选择的局限，可用于合并两个或更多品种的优良生产性状座位，可在品种内选择改良。比如说在肉质要求不断提高的今天，研究心脏脂肪酸结合蛋白基因对牛肉的嫩度、大理石花纹的调控机理，对肉牛高档肉、雪花肉等生产潜力提前预测，对于培育我国的高档肉牛品种有着重要的意义。MAS缩短了世代间隔，提高了选择强度，增加了选择的准确性。

参考文献：

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技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种基于眼肌面积为首选性状的肉牛早期选种方法，解决传统育种技术在实际生产中育种效果不佳的问题。提早选种时间，加快遗传进展。本发明中，延黄牛、草原红牛的眼肌面积遗传力分别为0.63和0.65；6月龄眼肌面积与不同月龄的体重、眼肌面积和净肉量均呈较强的遗传相关(0.657-0.715)，证明了眼肌面积可以作为肉用性状早期选择的典型指标，进而以眼肌面积来评价种牛的肉用性能。本发明基于考虑各项指标的全面性与可行性，根据各项指标的权重，本发明创立了以眼肌面积为首选性状的早期选种技术体系，在早选体系中强调眼肌面积、基因标记、体重指数、体尺指数、外貌指数5个性状指标的综合值，根据各个性状指标所占比例综合评分，进而实现提前选择种牛的目的，缩短选择时间，增加选种的准确性。

本发明的上述目的通过以下技术方案实现：

基于眼肌面积为首选性状的肉牛早期选种方法，包括如下步骤：

(1)利用超声波技术对待测犊牛进行眼肌面积检测，计算眼肌面积数值；

(1.1)在待选犊牛群体中对犊牛进行保定，以确保其自然站立；在将动物移至保定架或保定栏的过程中，要避免产生应激反应；

(1.2)测量时探头放上耦合剂，剪掉测量部位毛，探头直接放在体表；腰肌面积在横断面第十二、十三肋间测量，腰肌面积是一个圆周测量；在识别超声影像时首先确定皮肤界面、脂间结缔组织和背最长肌肌膜所产生的3～4条强回声影带，然后确定眼肌四周肌膜的强回声影像，以确定眼肌面积周界；观察并调节屏幕影像，调节灰度、对比度、增益度，使近场增大，远场减小，获得理想影像时即冻结影像，并加注说明资料影像打印或存贮处理；图像读取时先确定上下界即椭圆短轴，然后确定两端界点即为椭圆长轴；此时屏幕上显示的平方厘米值就是近似椭圆形的眼肌的面积；

(2)利用HRM技术对目标基因进行基因分型；

(2.1)设计目标基因序列的扩增引物，确立最佳PCR反应条件；

(2.2)进行HRM分型，根据标准化曲线区分出不同的基因型，然后从每个基因型中选取2-3个样品进行普通的PCR扩增；

(2.3)PCR产物回收、测序，判断目标基因型；

(3)待选牛体重测定；

为空腹24小时后的体重；

(4)待选牛体尺测量；

体尺测量指标涉及体长、胸围；

(5)依照牛体型外貌评定标准，对待选牛外貌进行评分；

(6)根据上述步骤(1)至步骤(5)的测定结果，建立早选指数计算公式；

早选指数ESI＝眼肌面积×0.35+基因标记×0.25+体重指数×0.20+体躯指数×0.15+外貌指数×0.05；结合上述5项指标的加权值，依据早选指数公式

得出早选指数值，然后根据早选指数进行排序，选留数值高的个体；公式中，P_n为该性状的个体表型值，为该性状的个体表型值的平均值，w_i为个体性状的经济重要性，h²为遗传力。

步骤(2.1)所述的设计目标基因序列的扩增引物，确立最佳PCR反应条件，具体是：

H-FABP基因5‘UTR上游引物序列：5’-TCTGCGTCTTTCCCAACCTA-3’

H-FABP基因5‘UTR下游引物序列：5’-GGCTCCCCAACCT GAC-3’

通过梯度PCR试验确定最佳试验温度，在200μL的PCR离心管中加入PCR反应扩增体系：2×PCR mix 10μL，上下游引物各0.2μL，DNA 0.5μL，用双蒸水ddH2O补齐至20μL；其中，2×PCR mix表示2倍PCR反应体系混合溶液；

将PCR管置于PCR仪中，设定反应条件为95℃预变性4min；95℃变性40s；设置55℃-65℃梯度退火30s；70℃延伸30s，从第二步开始35个循环；72℃延伸10min；4℃保存；取5μL PCR产物与6×上样缓冲液混合后，用浓度为1％琼脂糖凝胶在1×TAE中电泳检测30min；根据条带亮度及清晰度确定最终退火温度；其中，6×上样缓冲液表示6倍上样缓冲液；1×TAE缓冲液的配置：先配置50×TAE缓冲液:Tris 242g，冰乙酸57.1m1,0.5M EDTA(pH 8.0)100m1，加水至1000ml，然后稀释50倍以后即可得到1×TAE缓冲液；

在96孔PCR管中加入HRM反应扩增体系：取2×Master Mix 10μL加入上下游引物各0.5μL，MgCl2 2μL(2.5mM)，DNA 1μL(试验前将DNA稀释至50ng/μL)，用ddH₂O补齐至20μL；其中，2×Master Mix表示2倍荧光定量PCR反应体系混合溶液；MgCl₂ 2μL(2.5mM)表示2.5毫摩尔每升的MgCl₂溶液2微升；

冰上操作，充分混匀后封膜离心30s，放入荧光定量PCR仪；

PCR反应条件为：95℃10min，95℃10s，57℃退火15s，72℃20s，从第二步开始45个循环；95℃1min，40℃1min，65℃1s，然后温度以5℃/s的速率从65℃递增到95℃，最后温度降到40℃。

步骤(2.2)所述的进行HRM分型，根据标准化曲线区分出不同的基因型，然后从每个基因型中选取2-3个样品进行普通的PCR扩增，具体是：

在200μL的PCR离心管中加入PCR反应扩增体系：10×PCR Buffer with MgCl2 6.25μL，dNTP Mixture(10mm)2.25μL，下游引物各1μL，Taq DNA polymerase(2U/μL)1.5μL，DNA 1μL，最后用ddH₂O补齐至50μL；其中，10×PCR Buffer with MgCl₂表示含有MgCl₂的10倍PCR缓冲液；dNTP Mixture(10mM)表示10毫摩尔每升的dNTP混合液；Taq DNA polymerase(2U/μL)表示2单位每微升的taqDNA酶；ddH₂O表示双蒸水；

将PCR管置于PCR仪中，设定反应条件为95℃预变性4min；95℃变性40s；退火30s；70℃延伸30s，从第二步开始35个循环；72℃延伸10min；4℃保存；取5μL PCR产物与6×上样缓冲液混合后，用1％琼脂糖凝胶在1×TAE中电泳检测，PCR产物清晰且与预期大小一致的个体为符合要求个体。

步骤(2.3)所述的PCR产物测序，判断目标基因型，具体是：取每个样品的PCR产物10μL送测序公司测序；测序后，结合测序结果与分型的HRM标准曲线图(附图3)作为基因分型的判断依据，利用标准曲线图进行HRM基因分型，而后进行后期的计算。

本发明的有益效果在于：与现有技术相比，本发明以眼肌面积为首选性状，综合考虑了影响种牛评价的各项因素，制定了综合选择指数。综合考虑多个性状的评价，避免了错留单一性状高而其它性状低的个体，提高了整体的质量；综合选择对各个性状在经济上的重要性以及遗传力的高低都予以了充分考虑，经智能选择后避免了优秀个体因某一性状而淘汰；以眼肌面积和基因标记为主导，可以在6月龄时进行提前评定、选择，降低了选种周期，增加了准确性。依据综合选择指数对种牛进行早期选择，缩短了世代间隔，进而提高了育种效率，后备种牛初选时间从18月龄提前到了6月龄，提早1年。对整个肉牛育种领域的早期选种提供了实践依据。实用性强。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明的眼肌面积检测示意图；

图2为本发明的H-FABP基因PCR电泳检测图(扩增产物251bp)；

图3为本发明的H-FABP基因HRM曲线图及不同基因型对应测序结果。

具体实施方式

下面结合附图进一步说明本发明的详细内容及其具体实施方式。

参见图1至图3所示，本发明的基于眼肌面积为首选性状的肉牛早期选种方法，在待选犊牛群体中：

(1)利用超声波技术对待测犊牛进行眼肌面积检测，计算眼肌面积数值；

(1.1)对犊牛进行保定，以确保其自然站立。在将动物移至保定架或保定栏的过程中，要尽量减少产生应激反应。

(1.2)测量时探头放上耦合剂，剪掉测量部位毛，探头直接放在体表。腰肌面积在横断面第十二、十三肋间测量，腰肌面积是一个圆周测量。在识别超声影像时首先确定皮肤界面、脂间结缔组织和背最长肌肌膜所产生的3～4条强回声影带，然后确定眼肌四周肌膜的强回声影像，以确定眼肌面积周界。观察并调节屏幕影像，适当调节灰度、对比度、增益度，尽量使近场增大，远场减小，获得理想影像时即冻结影像，并加注说明资料影像打印或存贮处理。图像读取时先确定上下界即椭圆短轴，然后确定两端界点即为椭圆长轴。此时屏幕上显示的平方厘米值就是近似椭圆形的眼肌的面积。如图1所示。

(2)利用HRM技术对目标基因进行基因分型；

设计目标基因序列的扩增引物，确立最佳PCR反应条件。

进行HRM分型，根据标准化曲线区分出不同的基因型，然后从每个基因型中选取2-3个样品进行普通的PCR扩增。

PCR产物回收、测序，判断目标基因型。

以H-FABP基因为例，本部分检测通过以下技术方案实现：

H-FABP基因5‘UTR上游引物序列：5’-TCTGCGTCTTTCCCAACCTA-3’

H-FABP基因5‘UTR下游引物序列：5’-GGCTCCCCAACCT GAC-3’

通过梯度PCR试验确定最佳试验温度，在200μL的PCR离心管中加入PCR反应扩增体系：2×PCR mix 10μL，上下游引物各0.2μL，DNA 0.5μL，用双蒸水ddH₂O补齐至20μL；其中，2×PCR mix表示2倍PCR反应体系混合溶液；

将PCR管置于PCR仪中，设定反应条件为95℃预变性4min；95℃变性40s；设置55℃-65℃梯度退火30s；70℃延伸30s，从第二步开始35个循环；72℃延伸10min；4℃保存；取5μL PCR产物与6×上样缓冲液混合后，用浓度为1％琼脂糖凝胶在1×TAE中电泳检测30min；根据条带亮度及清晰度确定最终退火温度；其中，6×上样缓冲液表示6倍上样缓冲液；1×TAE缓冲液的配置：先配置50×TAE缓冲液:Tris 242g，冰乙酸57.1m1,0.5M EDTA(pH 8.0)100m1，加水至1000ml，然后稀释50倍以后即可得到1×TAE缓冲液；

在96孔PCR管中加入HRM反应扩增体系：取2×Master Mix 10μL加入上下游引物各0.5μL，MgCl2 2μL(2.5mM)，DNA 1μL(试验前将DNA稀释至50ng/μL)，用ddH₂O补齐至20μL；其中，2×Master Mix表示2倍荧光定量PCR反应体系混合溶液；MgCl₂ 2μL(2.5mM)表示2.5毫摩尔每升的MgCl₂溶液2微升；

冰上操作，充分混匀后封膜离心30s，放入荧光定量PCR仪。

PCR反应条件为：95℃10min，95℃10s，57℃退火15s，72℃20s，从第二步开始45个循环。95℃1min，40℃1min，65℃1s，然后温度以5℃/s的速率从65℃递增到95℃，最后温度降到40℃。

反应结束后根据HRM标准化曲线区分出三种不同的基因型(见附图3)，然后从每个基因型中选取2-3个样品进行普通的PCR扩增。

在200μL的PCR离心管中加入PCR反应扩增体系：10×PCR Buffer with MgCl2 6.25μL，dNTP Mixture(10mm)2.25μL，下游引物各1μL，Taq DNA polymerase(2U/μL)1.5μL，DNA 1μL，最后用ddH₂O补齐至50μL；其中，10×PCR Buffer with MgCl₂表示含有MgCl₂的10倍PCR缓冲液；dNTP Mixture(10mM)表示10毫摩尔每升的dNTP混合液；Taq DNA polymerase(2U/μL)表示2单位每微升的taqDNA酶；ddH₂O表示双蒸水。

将PCR管置于PCR仪中，设定反应条件为95℃预变性4min；95℃变性40s；退火30s；70℃延伸30s，从第二步开始35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。取5μL PCR产物与6×上样缓冲液混合后，用1％琼脂糖凝胶在1×TAE中电泳检测，PCR产物清晰且与预期大小一致的个体为符合要求个体，取10μLPCR产物送测序公司测序。测序后，结合测序结果与分型的HRM标准曲线图(附图3)作为基因分型的判断依据，利用标准曲线图进行HRM基因分型，而后进行后期的计算。

(3)待选牛体重测定；

测定空腹24小时后的犊牛体重，利用地磅、称重笼在同一时间测三次，取平均值。

(4)待选牛体尺测量；

犊牛自然站立，测定胸围、体长指标，做好记录。

体长：肩端至坐骨端的距离，测三次取平均值。

胸围：肩脚后角处体躯的垂直周径，测三次取平均值。

(5)依照牛体型外貌评定标准，对待选牛外貌进行评分

根据外貌线性评分标准，对外貌进行评分，并记录。评分标准见附表1。

(6)早选指数计算、排序

根据步骤(1)至步骤(5)测定结果，各性状表型值进行加权(个体表型值/群体均值，基因标记以基因型频率为表型值)，按照“早选指数ESI＝眼肌面积×0.35+基因标记×0.25+ 体重指数×0.20+体躯指数×0.15+外貌指数×0.05”进行计算，根据所得数值进行排序，根据排序结果对待选种牛进行取舍。

实施例1：对10头6月龄草原红牛进行早期选种，实现如下：

按照上述方法测定眼肌面积、基因标记、体重、体尺、外貌评分5项指标。

据各指标进行综合计算、比较。

首先设定：眼肌面积(EMA)的经济重要性w_i为：0.35，遗传力h²为：0.621；体重(BW)的经济重要性w_i为：0.20，遗传力h²为：0.614；体躯指数(BT)指数的经济重要性w_i为：0.15，遗传力h²为：0.423；FA的经济重要性w_i为：0.05，遗传力h²为：0.206；基因型取值AA为1，AB为0.5，BB为0；体躯指数(BT)＝胸围(CW)/体长(BL)×100。

使用R project开源软件，版本号为3.3.2(https://www.r-project.org/)，进行编程计算ESI指数。Num＝个体数，编号分别为N1,N2…N10…，EMA,BW,BL,CW,FA分别是表型性状值，GENO为基因型，ESI值即为公式中的I值

计算公式如下：

公式中，P_n为该性状的个体表型值，为该性状的个体表型值的平均值，w_i为个体性状的经济重要性，h²为遗传力。

早选指数计算结果：14.126375，12.123034，11.543484，9.893413，13.766669，11.381278，13.348411，12.411759，14.334776，11.651005；根据指数计算结果按牛号个体排序：9、1、5、7、8、2、10、3、6、4，也就是说按照这个结果个体9的指数最高、个体4的指数最低。

以上所述仅为本发明的优选实例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡对本发明所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

附表1种牛体型评分标准

来源：全国肉牛遗传改良计划——肉牛性能测定标准。