一种与猪眼肌面积性状有关的猪unc13b基因snp标志物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子遗传学中的遗传标记检测领域，具体涉及一种与猪眼肌面积性状 有关的猪UNC13B基因 SNP标志物。
【背景技术】
[0002] 我国是一个养猪大国，猪肉产量和质量的市场需求日益增加，提高猪肉产量、改善 猪肉胴体质量，成为育种科学家长期以来不断探索的工作。早期的育种工作主要集中于猪 的表型选择，随着基因组工作的不断推进和遗传标记的广泛开发，分子选择正逐步成为可 靠而有效的选择方法，结合表型与遗传标记的群体全基因组关联分析被广泛应用。
[0003] 单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP)是指群体中正常个体 的基因组DNA内特定核苷酸位置上存在两种或两种以上不同的碱基（等位基因），其中最少 一种在群体中的频率不少于1%。SNP作为第3代遗传标记，具有量大、高频率、低突变率等 优点，广泛应用于基因组分析、生物信息自动化检测、简单和复杂疾病的遗传研宄、畜牧育 种遗传标记及全球种族遗传学研宄等。
[0004] 目前，对猪SNP遗传标记的开发和研宄已取得一定的成果，如ESR和FSH基因的多 态性影响繁殖性状，IGFl基因 SNP影响生长性状，MSTN和FST基因跟猪胴体性状相关，Hal 基因影响猪肉质性状等。随着基因组技术的开展，已经找到的猪单碱基突变达两千八百多 万，然而如何有效的利用现有的数据和愈来愈低的测序成本挖掘出的新数据，开展猪的育 种工作，改善猪的胴体质量，将成为育种工作者长期而艰巨的任务。
[0005] 猪眼肌面积指猪最长肌的横断面面积，眼肌面积=眼肌高（CHi)X眼肌宽 (cm) X0. 7。猪个体的瘦肉率越高眼肌面积越大，由于眼肌面积性状与家猪产肉性能有强相 关性，所以在育种上显得尤为重要。UNC13B基因在肾皮质上皮细胞中表达，在高血糖症细胞 中表达上调，关于该基因的GO注释有甘油二酯结合活力和信号传导活力，但目前还没有就 该基因的单核苷酸多态性与眼肌面积的相关性的报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种利用UNC13B基因单碱基多态判断猪眼肌面积（LM)性 状的方法。
[0007] 为达到以上目的，本发明的发明人研宄了温氏大崑原种场杜洛克F2代资源群体， 记录了 F0、Fl和F2代个体的眼肌面积等性状，前期工作随机挑选5头杜洛克公猪和5头 杜洛克母猪对UNC13B (Sscrofa 10. 2)基因设计引物进行长片段PCR扩增，PCR产物胶回 收后进行ion torrent平台测序和samtools筛选SNPs，结果在基因组位置为1号染色 体正链263861722的位点找到一个T-C的突变，对应UNCl3B基因⑶S区发生AAT (天冬 酰胺）_AAC(天冬酰胺）的同义突变，以该SNP位点上下游序列为模板设计基因分型引物 (ASPl和ASP2)，利用GT48. 48芯片（Fludigm)，在200个大崑原种场杜洛克F2代资源群体 进行Fludigm基因分型，考虑性别以广义线性模型进行基因型与眼肌面积性状关联分析， 各基因型的最小二乘均值：TT型纯合子的眼肌面积为46. 99± I. 90, TC型杂合子的眼肌面 积为38. 59±0. 56, CC型纯合子的眼肌面积为39. 30±0. 53,结果显示TT型纯合子的猪眼 肌面积性状显著高于杂合子和CC型纯合子的猪（P = 0. 0597)。
[0008] 由此，得到一种与猪眼肌面积性状有关的猪UNC13B基因 SNP标志物，该标志物为 UNC13B (Sscrofa 10. 2)基因 chrl: 263861722 位点 T-C 的突变
[0009] 本发明还提供了一种用于检测所述的SNP标志物的特异性引物，所述引物为：
[0010] STA : 5' -CACACTCATTGTATCAATCATAGAGGAA-3'
[0011] LSP : 5' -AACCACCAAAGAGAGAGAGCCA-3，
[0012] ASPl :5，-AGAATTCCTACACGCTTGTTCTGAAT-3，
[0013] ASP2 :5' -GAATTCCTACACGCTTGTTCTGAAC-3，
[0014] 其中，STA(SEQ ID NO. 1)为预扩增上游引物，LSP(SEQ ID NO. 2)为预扩增下游引 物，ASP1(SEQ ID NO. 3)为分型引物 1，ASP2(SEQ ID NO. 4)为分型引物 2;
[0015] STA和LSP用于通过预扩增PCR获得UNC13B(Sscrofa 10. 2)基因 chrl:263861722 位点上下游共99bp的序列，ASPl和ASP2用于鉴定待测猪个体的UNC13B(Sscrofa 10. 2)基 因 chrl :263861722位点的基因型。
[0016] 本发明提供了一种检测所述的SNP标志物的方法，包括以下步骤：
[0017] 预扩增PCR :以待测猪基因组DNA为模板，本发明所提供的引物STA和LSP通过PCR 反应获得UNC13B (Sscrofa 10. 2)基因 chrl: 263861722位点上下游共99bp的序列（如SEQ ID NO. 5 所示）：CACACTCATTGTATCAATCATAGAGGAAGATAAGAATTCCTACACGCTTGTTCTGAA[T/C]CA GTAAGTATCACCTCACTTGGCTCTCTCTCTTTGGTGGTT，其中[T/C]所标注的位置为 SNP 位点。
[0018] 鉴定PCR :以预扩增产物为模板、ASPl和ASP2为引物，获得鉴定PCR扩增产物，判 定UNC13B (Sscrofa 10. 2)基因 chrl :263861722位点的SNP标志物的基因型。
[0019] 其中，所述预扩增PCR的反应体系为：
[0020] 2XMultiplex PCR Master Mix : 2.5 μ? IOxSTA primer pool : 0.5 μ? ddH20: 0.75 μ?
[0021] DNA 模板： 丨.2.5μΙ;
[0022] 预扩增PCR的反应程序为：95°C预变性15min ;95°C变性15s，60°C退火4min，14个 循环；72°C延伸5_8min。
[0023] 其中，所述鉴定PCR的反应可以根据所使用的基因分型芯片的说明书所给出的反 应程序和体系进行。例如，所述基因分型芯片可以为基于Fludigm基因分型平台的基因分 型芯片（美国FLUDIGM公司生产）。
[0024] 本发明还提供了一种检测猪眼肌面积性状的试剂盒，所述试剂盒中含有本发明所 提供的特异性引物。
[0025] 本发明还提供了所述SNP标志物或所述引物在猪育种中的应用。所述应用包括： 通过利用所述特异性引物对猪UNC13B(Sscrofa 10. 2)基因 chrl:263861722位点的基因型 进行检测，选择与最大猪眼肌面积性状相关的TT型猪进行培育。
[0026] 利用本发明所提供的方法可以通过对猪UNC13B基因单碱基多态的判断获得猪眼 肌面积性状，从而为猪的育种工作提供指导，选育具有最大猪眼肌面积的TT型猪进行育种 和培养。
【具体实施