一种与马氏珠母贝软体部重和闭壳肌重显著关联的snp298299标记及引物和应用
【技术领域】：
[0001] 本发明属于水产动物遗传及分子标记辅助育种技术领域，具体涉及一种与马氏珠 母贝软体部重和闭壳肌重显著关联的SNP298299标记及引物和应用。
【背景技术】：
[0002] 马氏珠母贝是我国及世界上海水珍珠养殖的主要物种。我国自1965年成功地开 展了马氏珠母贝人工育苗以来，海水珍珠产业发展迅速，已成为广东、广西及海南部分沿海 地区海水养殖支柱产业之一。近10多年，我国海水珍珠的质量和产量明显下降，国际竞争 力减弱，养殖经济效益下滑。就其原因，除了养殖环境恶化、养殖技术落后外，还有一个重要 原因是：多年来不注重种贝的选育和保留，缺乏优良品种；种苗质量参差不齐，育珠母贝性 状退化，如生长慢、个体小型、育珠能力减弱等。为了我国海水珍珠养殖业的健康稳定发展， 培育适合我国海区养殖的马氏珠母贝优良品种已迫在眉睫。
[0003] 育种技术有杂交、选择育种，生物技术育种及分子育种等多种方法。分子育种是 目前国内外研宄的热点，是育种技术发展的主要方向，它具有高效、快捷的特点。分子育 种离不开分子标记的开发，用在海洋贝类遗传育种研宄的分子标记主要有限制片段长度 多态性（RFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、扩增片段长度多态性（AFLP)、锚定简单重复 序列（ISSR)、简单重复序列（SSR)、单核苷酸多态性（SNP)、表达序列标签（EST)、线粒体 DNA(mtDNA)、核糖体DNA内转录间隔区标记（ITS)分子标记等。Qiu等对合浦珠母贝不 同群体进行EST-SSR标记与生长及珍珠层性状的关联分析，结果表明在野生群体中基因 PmartE05、PmartE35与壳高、总重显著相关，基因 PmartE64与珍珠层厚度显著相关，在养殖 群体中发现基因 PmartE05与壳高显著的相关。Cong等利用SNP标记研宄太平洋牡蛎的胰 岛素相关多肽基因（oIRP)的多态性与生长性状的关联分析，发现在oIRP基因1.5kb处发 现31个SNPs，其中6个与生长性状显著相关，特别是标记T1358G和标记G1437A与壳高、壳 长、壳宽、总重、软体部重5个生长性状显著相关。软体部重和闭壳肌重是在活体状态下无 法测定的指标，它们对珍珠贝培育珍珠有很大的影响，要想实现对这两个性状的选择，只有 依靠与它们间接相关的易于测定的指标，或者依靠关联的分子标记来选择。
【发明内容】
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[0004] 本发明的第一个目的是提供一种与马氏珠母贝软体部重和闭壳肌重显著关联的 SNP298299标记的检测引物。
[0005] 本发明的与马氏珠母贝软体部重和闭壳肌重显著关联的SNP298299标记的检测 引物，其特征在于，其核苷酸序列如下：
[0006] 298299FI:GGAATTCGTATCACTGTTTGAAGCAAGG ;
[0007] 298299RI:GGGAACACATCCCACATTTAACAATGTTA ;
[0008] 298299F0:TTGATAGCGGAATAGGCACATTCAATTT ；
[0009] 298299RO:TTAAAAGGCAAAGAAAACTTTGGCATCAG。
[0010] 本发明的第二个目的是提供一种与马氏珠母贝软体部重和闭壳肌重显著关联的 SNP298299标记，其特征在于，其特异性检测引物为：
[0011] 298299FI:GGAATTCGTATCACTGTTTGAAGCAAGG ;
[0012] 298299RI:GGGAACACATCCCACATTTAACAATGTTA ;
[0013] 298299FO:TTGATAGCGGAATAGGCACATTCAATTT ；
[0014] 298299RO:TTAAAAGGCAAAGAAAACTTTGGCATCAG。
[0015] 本发明的第三个目的是提供与马氏珠母贝软体部重和闭壳肌重显著关联的 SNP298299标记在鉴定马氏珠母贝软体部重和闭壳肌重大小中的应用，其特征在于，包括以 下步骤：
[0016] a、提取马氏珠母贝样品基因组DNA ;
[0017] b、采用上述引物298299FI、298299RI、298299FO、298299RO对马氏珠母贝样品基 因组DNA进行PCR扩增；
[0018] c、根据PCR扩增产物对马氏珠母贝样品进行鉴定，当出现具有202bp和236bp大 小2条带的为GT型；当只出现202bp大小1条带的为GG型。GG型个体的软体部重和闭壳 肌重显著大于GT型个体的样品。
[0019] 优选，所述的PCR扩增，其PCR反应体系为：25 μ I^PCR反应体系如下：包含马氏珠 母贝样品基因组 DNA 50ng，2XPCRMixture 12.5yL，检测引物 298299FI 2yL、298299RI 2yL、298299FO 0.5yL、298299R0 0.5yL(各引物浓度均为 10pmol/yL)，0.0625U Taq DNA酶，余量为水；反应条件为：94°C预变性5min ;94°C 40s，56°C 40s ;72°C 40s，35个循环； 72°C 延伸 5min。
[0020] 本发明的第四个目的是提供与马氏珠母贝软体部重和闭壳肌重显著关联的 SNP298299标记在马氏珠母贝分子标记辅助育种中的应用。
[0021] 利用本发明的与马氏珠母贝软体部重和闭壳肌重相关联的SNP298299标记的检 测引物，能够扩增出两种SNP基因型位点，再根据PCR扩增电泳图可直观地比较个体间软体 部重和闭壳肌重的大小，可直接用于后续的分子标记辅助育种，如可在生长早期筛选目标 性状，进而筛选特定的个体进行品种培育。
【附图说明】：
[0022] 图1是与马氏珠母贝软体部重和闭壳肌重相关联的SNP298299标记的扩增电泳 图，其中泳道1 _12为马氏珠母贝样品，M为marker。
【具体实施方式】：
[0023] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0024] 实施例1 :
[0025] 随机取来自于同一群体的96个马氏珠母贝个体，清洗干净后，取其软体部重称 重，然后取其闭壳肌组织称重并一一对应记录，取一小块闭壳肌组织置于95%乙醇中， 于-20°C保存。使用HiPure Universal DNA Kit (广州美基生物公司）对来自96个马氏珠母 贝个体的闭壳肌的基因组DNA进行提取，相关操作参见试剂盒说明书进行。DNA提取后，于 I. 0%的琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，紫外分光光度计测量DNA的浓度和纯度，于-20°C 保存。
[0026] 与马氏珠母贝软体部重和闭壳肌重相关联的SNP298299标记的检测引物为：
[0027] 298299FI:GGAATTCGTATCACTGTTTGAAGCAAGG ;
[0028] 298299RI:GGGAACACATCCCACATTTAACAATGTTA ;
[0029] 298299FO:TTGATAGCGGAATAGGCACATTCAATTT ；
[0030] 298299RO:TTAAAAGGCAAAGAAAACTTTGGCATCAG。
[0031] 用上述引物298299FI、298299RI、298299FO、298299RO对马氏珠母贝样品基因组 DNA在PCR仪上进行PCR扩增。其PCR反应体系为：25 μ L。PCR反应体系如下：包含马氏珠 母贝样品基因组 DNA 50ng，2XPCRMixture 12.5yL，检测引物 298299FI 2yL、298299RI 2yL、298299FO 0.5yL、298299R0 0.5yL(各引物浓度均为 10pmol/yL)，0.0625U Taq DNA酶（广州东盛生物科技有限公司），余量为水；反应条件为：94°C预变性5min ;94°C 40s， 56°C 40s ;72°C 40s，35 个循环；72°C延伸 5min。
[0032] PCR产物用3%琼脂糖（广州康龙科技生物公司）凝胶电泳，用凝胶成像系统观 察电泳图谱。分型电泳图如图1所示，当出现具有202bp和236bp大小2条带的为GT型 (泳道11);当只出现202bp大小1条带的为GG型（泳道2-10、12)。在这96个个体中，GG 型个体84个，软体部重5. 37±2. 04g，肌肉重0. 87±0. 41g，GT型个体有12个，软体部重 4. 0±1.69g，闭壳肌重0. 56±0. 32g。采用SPSS 17. 0软件中的t-test检验，GG型个体的 软体部重和闭壳肌重显著大于GT型个体（p〈0. 05)，即认为它们之间具有极其显著的统计 学差异。
【主权项】
1. 一种与马氏珠母贝软体部重和闭壳肌重显著关联的SNP298299标记的检测引物，其 特征在于，其核苷酸序列如下： 298299 FI:GGAATTCGTATCACTGTTTGAAGCAAGG ; 298299 RI:GGGAACACATCCCACATTTAACAATGTTA ; 298299 FO:TTGATAGCGGAATAGGCACATTCAATTT ； 298299 RO:TTAAAAGGCAAAGAAAACTTTGGCATCAG〇
2. -种与马氏珠母贝软体部重和闭壳肌重显著关联的SNP298299标记，其特征在于， 其特异性检测引物为： 298299 FI:GGAATTCGTATCACTGTTTGAAGCAAGG ; 298299 RI:GGGAACACATCCCACATTTAACAATGTTA ; 298299 FO:TTGATAGCGGAATAGGCACATTCAATTT ； 298299 RO:TTAAAAGGCAAAGAAAACTTTGGCATCAG〇
3. 权利要求2所述的与马氏珠母贝软体部重和闭壳肌重显著关联的SNP298299标记在 鉴定马氏珠母贝软体部重和闭壳肌重大小中的应用，其特征在于，包括以下步骤： a、 提取马氏珠母贝样品基因组DNA ; b、 采用权利要求1所述的检测引物298299?1、2982991?1、298299?0、2982991?0对马氏珠 母贝样品基因组DNA进行PCR扩增； c、 根据PCR扩增产物对马氏珠母贝样品进行鉴定，当出现具有202bp和236bp大小2 条带的为GT型；当只出现202bp大小1条带的为GG型；GG型个体的软体部重和闭壳肌重 显著大于GT型个体的样品。
4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的PCR扩增，其PCR反应体系 为：25yL。PCR反应体系如下：包含马氏珠母贝样品基因组DNA 50ng，2XPCR Mixture 12. 5yL，浓度为10pmol/yL的权利要求1所述的检测引物298299FI 2yL、298299RI 2yL、298299F0 0.5yL、298299R0 0.5yL，0.0625U Taq DNA 酶，余量为水；反应条件为： 94°〇预变性51^11;94°0 4〇8,56°0 4〇8;72°0 4〇8,35个循环；72°0延伸51^11。
5. 权利要求2所述的与马氏珠母贝软体部重和闭壳肌重显著关联的SNP298299标记在 马氏珠母贝分子标记辅助育种中的应用。
【专利摘要】本发明公开一种与马氏珠母贝软体部重和闭壳肌重显著关联的SNP298299标记及引物和应用。引物包括:298299FI:GGAATTCGTATCACTGTTTGAAGCAAGG；298299RI:GGGAACACATCCCACATTTAACAATGTTA；298299FO:TTGATAGCGGAATAGGCACATTCAATTT；298299RO:TTAAAAGGCAAAGAAAACTTTGGCATCAG。利用本发明的引物能扩增出两种SNP基因型位点，再根据PCR电泳图可直观地比较个体间软体部重和闭壳肌重的大小，可直接用于后续的分子标记辅助育种。
【IPC分类】C12N15-11, C12Q1-68
【公开号】CN104561305
【申请号】CN201410856451
【发明人】何毛贤, 李耀国
【申请人】中国科学院南海海洋研究所
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年12月31日