一种检测阪崎克罗诺杆菌的目的核苷酸序列及检测试剂盒与检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及食源致病微生物检测领域，尤其涉及一种检测阪崎克罗诺杆菌的目的 核苷酸序列及检测试剂盒与检测方法。
【背景技术】
[0002] 阪崎克罗诺杆菌（Cronobacter sakazakii)，是一种食源性条件致病菌，隶属于克 罗诺杆菌属（Cronobacter spp)。该菌能引起脑膜炎、菌血症、坏死性小肠结肠炎等疾病，死 亡率高达50% -80%，存活者也将终身遭受神经系统后遗症的危害。其主要危害人群为免 疫力低下人群，特别是早产儿、出生体重偏低的婴幼儿。因而国际食品微生物标准委员会将 其定为"严重危害特定人群，威胁生命或导致慢性实质性后遗症"的细菌。阪崎克罗诺杆菌 广泛存在于自然界中，乳制品，水果，蔬菜，杂粮等均曾分离出该菌。此外，阪崎克罗诺杆菌 还存在于食品工厂各种设备以及家庭中厨房器具上，能够导致食物的二次污染。阪崎克罗 诺杆菌的广泛存在严重地威胁了人类的生命健康，而对于阪崎克罗诺杆菌的快速检测可以 做到对于其传播感染的有效控制。
[0003] 克罗诺杆菌2008年被确认为一个新属，截止2014年为止共有7个种： Cronobacter sakazakii、 Cronobacter dublinensis、 Cronobacter malonaticus、 Cronobacter muytjensii、Cronobacter turicensis、Cronobacter universalis 和 Cronobacter condimentii。目前用于检测和鉴定克罗诺杆菌的方法主要是基于生理生化 试验，但是这些方法都存在检测周期长、操作繁琐等缺点，因而难以实现对污染样品的快速 诊断。已有的基于PCR的检测方法能够在较短时间里确认结果，但这些方法多数集中于检 测克罗诺杆菌属，能够检测阪崎克罗诺杆菌的则较为较为罕见。因此目前对于阪崎克罗诺 杆菌的检测方法是缺乏且无法满足需求的。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是为了弥补现有检测技术检测周期长，操作繁琐，灵敏度不够等不 足而提供了一种检测阪崎克罗诺杆菌的目的核苷酸序列及检测试剂盒与检测方法。所述试 剂盒检测时间短，抗干扰能力强，具有较高的特异性而不受属内其他种的影响。
[0005] 技术方案
[0006] -种检测阪崎克罗诺杆菌的目的核苷酸序列，该序列包括152bp，序列为GGCAGCA TGTCATTATCGGACGCCAGCGACACGCCGGTGTACGCGACACTGTCGAAGACTTTGGCGTCAGTATTTCCTTCGCCT ATCATCAGCCGGCTTTTCAGCGTGCGAATATCACGGGAGACGTGGCTGTAGACCGAATGCCACTGATG。
[0007] -种阪崎克罗诺杆菌检测方法，包括以下步骤：
[0008] (1)提取待测样品的基因组DNA ;
[0009] (2)以步骤⑴提取的基因组DNA为模板，以CS21-L和CS21-R引物对CS21进 行PCR反应，其中CS21-L引物序列为5' -GGCAGCATGTCATTATCGG-3'，CS21-R引物序列为 5' -CATCAGTGGCATTCGGTCTA-3' ；
[0010] (3)检测PCR产物中是否存在大小为权利要求I所述的152bp的单一扩增产物。
[0011] 所述的阪崎克罗诺杆菌检测方法，步骤（2)中PCR反应的条件为10XPCR buffer， 10-15mM MgCl2,0. 2-0. 3mM (1ΝΤΡ，10-100μΜ 引物 CS21-L，10-100yM 引物 CS21-R，l-10ng/ μ L基因组DNA，0. 5-?υ/μ L Taq DNA聚合酶，其余以双蒸水补齐；PCR反应程序为：①94°C， 5min ;② 94°C，30s ;③ 6(TC -62°C，30s ;④ 72°C，30s-60s ;⑤ 72°C，7-10min ;⑥ 4°C保存；其 中②至④共30-35个循环。
[0012] 所述的阪崎克罗诺杆菌检测方法，步骤（2)中PCR反应的条件为10XPCR buffer， 15mM MgCl2,0. 2mM dNTP，10 μ M引物CS21-L，10 μ M引物CS21-R，lng/ μ L基因组DNA，IU/ μ L Taq DNA聚合酶，其余以双蒸水补齐；PCR反应程序为：①94°C，5min ;②94°C，30s ;③60°C， 30s ;④72°C，30s ;⑤72°C，10min ;⑥4°C保存；其中②至④共35个循环。
[0013] 所述的阪崎克罗诺杆菌检测方法，步骤（3)中检测PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳 或聚丙烯酰胺凝胶电泳进行。
[0014] 一种阪崎克罗诺杆菌检测试剂盒，包括：PCR buffer，MgCl2溶液，dNTP，CS21-L引 物：5' -GGCAGCATGTCATTATCGG-3'，CS21-R 引物：5' -CATCAGTGGCATTCGGTCTA-3' 和 Taq DNA 聚合酶；
[0015] 进一步地，所述的阪崎克罗诺杆菌检测试剂盒，包括：10XPCR buffer，10-15mM MgCl2溶液，0.2-0. 3mM dNTP，10-100 μ M CS21-L 引物：5'-GGCAGCATGTCATTATCGG-3'， 10-100 μ M CS21-R 引物：5' -CATCAGTGGCATTCGGTCTA-3' 和 0· 5-1U/ μ L Taq DNA 聚合酶。
[0016] 所述的阪崎克罗诺杆菌检测试剂盒，所述试剂盒还包括含有权利要求1所述的目 的核苷酸序列的阪崎克罗诺杆菌标准菌株的DNA标准品。
[0017] 在本发明中扩增产物的判定原则为：PCR反应之后，通过凝胶电泳检测，若步骤 (2)所得的PCR反应产物在152bp位置有对应产物，则判定结果为阳性，若所得的反应产物 在152bp没有对应产物，则结果判定为阴性。
[0018] 本发明适用于食品样品，尤其是婴幼儿配方奶粉的检测。
[0019] 有益效果
[0020] 本发明提供的一种阪崎克罗诺杆菌检测试剂盒及其检测方法，具有快速、特异性 好、抗干扰能力强、结果判定简单的优点，同时灵敏度高，经验证，利用本发明提供的方法判 定基因组的最低检测下限为USfgyL'细胞检测下限为5.5X103CFU mL'本发明对于我 国食品安全具有着重要意义。
【附图说明】
[0021] 图1为实施例1中引物对CS21以阪崎克罗诺杆菌属内六个种为模板进行PCR反 应的2%琼脂糖凝胶电泳检测结果。图中，M :DS? 2000DNA marker ;N:阴性对照（CldH2O); 泳道1 - 6依次为：阪崎克罗诺杆菌CICC21560,穆汀斯克罗诺杆菌CICC21563,丙二酸盐 阳性克罗诺杆菌DSM18702,苏黎世克罗诺杆菌DSM18703,都柏林克罗诺杆菌DSM18705和 Cuniversalis NCTC9529。
[0022] 图2为实施例1中测定基因组检测灵敏度和细胞检测灵敏度的PCR产物2%琼脂 糖凝胶电泳结果。图中，M:DS? 2000DNA marker;N:阴性对照（CldH2O);图A对应于基因组 检测灵敏度，泳道1-7分别对应不同基因组DNA浓度：13. 5ng μ L-1，I. 35ng μ L-1，135pg μ?Λ?3·5ρ8 μ?Λ?·35ρ8 μ?Λ?35?^ μ?Λ?3·5?^ μ?Λ 图 B 对应于细胞的检测 灵敏度，泳道 1-8 分别对应细胞浓度 5. 5 X IO7CFU ml/1，5. 5 X IO6CFU ml/1，5. 5 X IO5CFU mL' 5· 5 X IO4CFU mL' 5· 5 X IO3CFU mL' 5· 5 X IO2CFU mL' 5· 5 X IO1CFU mL' 5· 5 X IO0CFU mL 1
[0023] 图3为实施例1中测定抗干扰能力的PCR产物2%琼脂糖凝胶电泳检测结果。 图中，M :DS? 2000DNA marker ;N :阴性对照（CldH2O)。图中：泳道1-10对应大肠杆菌 CMCC23657 的细胞浓度分别为 IO8CFU mL'IO7CFU mL-1，IO6CFU mL-1，IO5CFU mL-1，IO4CFU mL' IO3CFU mL' IO2CFU mL' IO1CFU mL' IO0CFU mL-1，KT1CFU mL'
[0024] 图4为实施例2中PCR产物2%琼脂糖凝胶电泳检测结果。图中，M :DS? 2000DNA marker ;图A :泳道1-7对应阪崎克罗诺杆菌起始接种量为5. SXIOiCFU ml/1时的取样时间： 0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h。泳道8-14对对应阪崎克罗诺杆菌起始接种量为5. 5X10°CFU ml/1时的取样时间：0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h。图B :泳道1-7对应阪崎克罗诺杆菌起始接 种量为5. SXIOiCFU ml/1时的取样时间：0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h。泳道8-14为对照，其 取样时间分别为：〇h、2h、4h、6h、8h、10h、12h。
【具体实施方式】
[0025] 下面通过实施例和附图的方式来说明和解释本发明，但本发明并不只是限制在所 述的实施例范围。本实例中，所有引物均交付上海生工生物工程技术服务有限公司合成，所 使用的DNA标准分子量DS? 2000DNA marker购置广州东盛生物科技有限公司。
[0026] 实施例1 :对阪崎克罗诺杆菌标准菌株CICC21560的检测
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