1)采用本发明的一对引物CS21对阪崎克罗诺杆菌标准菌株CICC21560进行PCR 检测。
[0028] 所用引物对CS21的序列如下：
[0029] CS21-L :5, -GGCAGCATGTCATTATCGG-3, ；（SEQ ID NO. 1)
[0030] CS21-R :5, -CATCAGTGGCATTCGGTCTA-3，。（SEQ ID NO. 2)
[0031] 所对应的PCR扩增产物大小为152bp。
[0032] 本发明所使用的PCR反应体系如下：
[0033] 较佳的反应体系为：10XPCR buffer，10-15mM MgCl2,0. 2-0. 3mM (1ΝΤΡ，10-100μΜ 引物〇521-1^，10-10(^]?引物〇521-1?，1-10叩/^1^基因组0嫩，0.5-川/^1^了&9 0嫩聚合酶， 其余以双蒸水补齐。较佳的PCR反应条件为：①94°C，5min ;②94°C，30s ;③60°C -62°C， 30s ;④72°C，30s ;步骤②至④共30-35个循环；⑤72°C，10min ;⑥4°C保存。
[0034] 在较佳的反应条件下，均能够获得单一的，清晰的152bp大小条带。
[0035] 通过优化获得的更佳反应条件如下：10XPCR buffer，15mM MgCl2,0. 2mM dNTP， 10以]?引物〇521-1^1(^]\1引物〇521-1?，1叩/^1^基因组0嫩14 1^川/^1^丁&9〇嫩聚合 酶，其余以双蒸水补齐。所述PCR反应程序为：①94°C，5min ;②94°C，30s ;③60°C，30s ; ④72°C，30s ;步骤②至④共30个循环；⑤72°C，10min ;⑥4°C保存。
[0036] 在优化的更佳条件下，所获得的152bp PCR扩增产物条带最清晰，最为明亮。
[0037] 因此本发明所建立的PCR检测方法如下：
[0038] 在 PCR 反应管中依次加入 10XPCR buffer 2· 5 μ L，15mM MgCl22 μ L，0. 2mM dNTP IyL, 10uM^|^CS21-L I μ L, 10 μ M CS21-R I μ L, lng/μ L DNA IyL, lU/yL Taq DNA聚合酶I μ L，其余以双蒸水补齐，总体积为25 μ L，并设置阳性对照和阴性对照。将 PCR反应管放入离心机离心混匀反应体系后，放入PCR仪，按照如下条件进行反应：①94°C， 5min ;② 94°C，30s ;③ 60°C，30s ;④ 72°C，30s ;步骤②至④共 35 个循环；⑤ 72°C，10min ; ⑥4°C保存。PCR扩增产物通过2%琼脂糖凝胶电泳检测。图1即为CS21的PCR检测结果， 其条带大小为152bp，清晰可见。因此，该152bp的序列片段可以作为检测阪崎克罗诺杆菌 的目的核苷酸序列，该目标核苷酸序列为GGCAGCATGTCATTATCGGACGCCAGCGACACGCCGGTGTAC GCGACACTGTCGAAGACTTTGGCGTCAGTATTTCCTTCGCCTATCATCAGCCGGCTTTTCAGCGTGCGAATATCACG GGAGACGTGGCTGTAGACCGAATGCCACTGATG。（SEQ ID NO. 3)
[0039] (2)特异性评价试验
[0040] 将阪崎克罗诺杆菌标准菌株CICC21560和6株阪崎克罗诺杆菌食品分离株，以及 同属于克罗诺杆菌属的其他5个种，接种于LB培养基中，于37°C，180rpm过夜培养；取ImL 菌液于I. 5mL离心管中，12000rpm 2min后弃去上清；按照常规的基因组提取方法提取并纯 化基因组DNA ;基因组DNA放置于-20°C备用。六株阪崎克罗诺杆菌食品分离菌株通过生理 生化鉴定区分到种。表1中所示的克罗诺杆菌属外的其他细菌的基因组DNA提取和纯化类 似。本发明所涉及的菌株均可以通过公开途径获得。
[0041] 将提取的基因组DNA稀释至IOng/ μ L后各取1 μ L作为模板进行PCR反应。反应 完毕之后，2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，根据是否在152bp处有单一条带来判断 结果为阴性还是阳性。详细的PCR结果见表1。
[0042] 表1中共涉及34株菌株，克罗诺杆菌属共计12株，其中，标准菌株6株：阪崎克罗 诺杆菌，都柏林克罗诺杆菌，穆汀斯克罗诺杆菌，丙二酸盐阳性克罗诺杆菌，苏黎世克罗诺 杆菌，C. universalis ;阪崎克罗诺杆菌分离株6株。克诺罗杆菌属外共22株菌株，其中，大 肠杆菌4株，沙门氏菌属9株，金黄色微球菌1株，荧光假单胞菌1株，李斯特属2株，蜡样 芽胞杆菌1株，枯草芽孢杆菌1株，阴沟肠杆菌1株，藤黄微球菌1株，短小芽孢杆菌1株。 表1为特异性评价试验的PCR结果，结果表明除阪崎克罗诺杆菌标准菌株和食品分离株外， 其余PCR结果均为阴性，这表明本发明中的检测方法具有较高的特异性。
[0043] 表1 :特异性评价所使用的菌株及其PCR结果
[0044]
[0045]
【主权项】
1. 一种检测阪崎克罗诺杆菌的目的核苷酸序列，其特征在于，该序列包括152bp序 列为 GGCAGCATGTCATTATCGGACGCCAGCGACACGCCGGTGTACGCGACACTGTCGAAGACTTTGGCGTCA GTATTTCCTTCGCCTATCATCAGCCGGCTTTTCAGCGTGCGAATATCACGGGAGACGTGGCTGTAGACCGAATG CCACTGATG。
2. -种阪崎克罗诺杆菌检测方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 提取待测样品的基因组DNA ; (2) 以步骤（1)提取的基因组DNA为模板，以CS21-L和CS21-R引物对CS21进行 PCR反应，其中CS21-L引物序列为5' -GGCAGCATGTCATTATCGG-3'，CS21-R引物序列为 5' -CATCAGTGGCATTCGGTCTA-3' ； (3) 检测PCR产物中是否存在大小为权利要求1所述的152bp的单一扩增产物。
3. 根据权利要求2所述的阪崎克罗诺杆菌检测方法，其特征在于，步骤（2)中PCR反 应的条件为 IOXPCR buffer，10-15mM MgCl2,0. 2-0. 3mM (1ΝΤΡ，10-100μΜ 引物 CS21-L， 10-100 μΜ 引物 CS21-R，l-10ng/y L 基因组 DNA，0.5-1 U/μ L Taq DNA 聚合酶，其余 以双蒸水补齐；PCR反应程序为：①94°C，5min ;②94°C，30s ;③60°C -62°C，30s ;④72°C， 30s-60s ;⑤72°C，7-10min ;⑥4°C保存；其中②至④共30-35个循环。
4. 根据权利要求2所述的阪崎克罗诺杆菌检测方法，其特征在于，步骤（2)中PCR反 应的条件为 10XPCR buffer，15mM MgCl2,0.2mM (1ΝΤΡ，10μΜ 引物 CS21-L，10 μΜ 引物 0521-1?，1叩/^1^基因组0嫩，1"以1^了&9〇嫩聚合酶，其余以双蒸水补齐屮0?反应程序 为：① 94?，5min ;② 94?，30s ;③ 6(TC，30s ;④ 72?，30s ;⑤ 72?，IOmin ;⑥ 4?保存；其 中②至④共35个循环。
5. 根据权利要求2所述的阪崎克罗诺杆菌检测方法，其特征在于，步骤（3)中检测PCR 产物通过琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳进行。
6. -种阪崎克罗诺杆菌检测试剂盒，其特征在于，包括：PCR ^^€61*，1%(：12溶液，(1阶？， CS21-L 引物：5, -GGCAGCATGTCATTATCGG-3，，CS21-R 引物：5, -CATCAGTGGCATTCGGTCTA-3' 和TaqDNA聚合酶。
7. 根据权利要求6所述的阪崎克罗诺杆菌检测试剂盒，其特征在于，包括： 10XPCR buffer，10-15mM MgCl2 溶液，0.2-0. 3mM dNTP，10-100 μ M CS2 卜L 引物： 5, -GGCAGCATGTCATTATCGG-3,，10-100 μ M CS21-R 引物：5, -CATCAGTGGCATTCGGTCTA-3,和 0.5-1 U/μ L TaqDNA 聚合酶。
8. 根据权利要求6所述的阪崎克罗诺杆菌检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包 括含有权利要求1所述的目的核苷酸序列的阪崎克罗诺杆菌标准菌株的DNA标准品。
【专利摘要】本发明公开了一种检测阪崎克罗诺杆菌目的核苷酸序列及检测试剂盒与检测方法，其中目的核苷酸序列如SEQ？ID？NO.3所示，试剂盒包括：PCR？buffer，MgCl2溶液，dNTP，CS21-L引物，CS21-R引物和TaqDNA聚合酶；检测方法为首先提取待测样品的基因组DNA，然后以提取的基因组DNA为模板，以CS21-L和CS21-R引物对CS21进行PCR反应，最后检测PCR产物中是否存在大小为152bp的单一扩增产物。该方法具有检测时间短，抗干扰能力强，成本低，特异性好，灵敏度高的优点，对我国的食品安全具有重要意义。
【IPC分类】C12Q1-04, C12R1-01, C12N15-11, C12Q1-68
【公开号】CN104561295
【申请号】CN201410835984
【发明人】陆兆新, 陈启明, 别小妹, 吕凤霞, 赵海珍, 张充
【申请人】南京农业大学
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年12月29日