血液直接pcr法检测叶酸代谢相关基因多态性的引物、引物组、试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学检测，尤其涉及一种血液直接PCR法检测叶酸代谢相关基 因多态性的引物、引物组、试剂盒及检测方法。
【背景技术】
[0002] 叶酸属B族维生素，是合成核酸所必须的元素，是细胞生长和组织修复所必需的 物质，更是胚胎发育过程中不可缺少的营养素。近年来大量研究已经证实，叶酸缺乏是导致 出生缺陷的主要原因。叶酸的临床功能除了预防胎儿神经管缺陷外，还能降低孕妇妊娠高 血压、自发性流产和胎儿宫内发育迟缓、早产以及新生儿低出生体重等发病率。
[0003] 科学研究发现，叶酸利用能力受遗传结构(基因）影响，如果与叶酸代谢相关的酶 活性偏低（即相关基因功能异常)，这一人群如按常量（400微克/天)补充叶酸，机体叶酸水 平也会不足。遗传体质的差异导致了机体对叶酸利用能力的差异，因此，叶酸增补应因人而 异，增补过多或过少都不利于胎儿健康和孕妇健康。
[0004] 科学研究已经证实，与甲基类维生素（叶酸及维生素 B12)代谢密切相关的基因是 MTHFR和MTRR。MTHFR编码蛋白5, 10-亚甲基四氢叶酸还原酶，MTRR编码蛋白甲硫氨酸合 成酶还原酶。MTHFR和MTRR基因变异会引起相应的酶活性降低，阻抑同型半胱氨酸转化为 甲硫氨酸，导致低叶酸血症和高同型半胱氨酸血症，从而增加新生儿出生缺陷风险或自发 性流产等风险。
[0005] MTHFR 全称 5, l〇-methylenetetrahydrofolatereductase(5, 10-亚甲基四氢叶酸 还原酶)，位于一号染色体1ρ36. 3位置。MTHFE全长19. 3kb，mRNA全长7105bp，共有外显子 12个，编码共有657个氨基酸编码子的蛋白。亚甲基四氢叶酸还原酶催化5, 10-亚甲基四 氢叶酸转换成5-甲基四氢叶酸盐，使之能为同型半胱氨酸提供甲基甲硫氨酸。该酶是人体 叶酸代谢中的一个十分重要的酶。
[0006] MTRR 全称 5-methyltetrahydrofolate-homocysteinemethyltransferase reductase,编码甲硫氨酸合成酶还原酶，位于5pl5.3-pl5. 2。MTRR基因全长32021 kb， mRNA全长3274bp，共有15个外显子，编码具有726个氨基酸的蛋白质。甲硫氨酸是蛋白质 合成和一碳代谢的必须氨基酸，它的合成是由甲硫氨酸合酶（MTR编码)催化的，而甲硫氨酸 合酶因为辅助因子维生素 B12被氧化而最终失活。MTRR编码的甲硫氨酸合成酶还原酶能够 通过还原型甲基化作用重新生成具有功能活性的甲硫氨酸合酶。甲硫氨酸合成酶还原酶是 具有电子转移作用的铁氧化还原蛋白-NADP ( + )还原酶（ferredoxin-NADP ( + )reductase， FNR)家族成员。MTRR突变是造成叶酸/甲基维生素缺乏症的主要病因。
[0007] CN103834733A(2014-6-4)公开了一种单管联合测定乙醛脱氢酶2基因与亚甲基 四氢叶酸还原酶基因突变位点的试剂盒及其测定方法，所述试剂盒包括：全血基因组DNA 提取试剂、多重PCR扩增引物、多重PCR扩增反应试剂、单链DNA分离和纯化试剂、焦磷酸测 序引物、焦磷酸测序试剂和盒体。所述方法：人类全血基因组DNA提取；多重PCR扩增反应； 单链DNA样本分离和纯化；焦磷酸测序与结果分析。用途：希望了解个体对乙醇和叶酸代谢 能力情况的健康体检者；预测个体对硝酸甘油代谢能力和疗效，指导心梗患者合理选择和 备用血管舒张急救药物；预测个体对叶酸的代谢能力，指导孕产妇和儿童补充适合剂量的 叶酸补充剂等。然而该方法需要抽提基因组DNA。
[0008] 目前市面上检测5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因（MTHFR)、甲硫氨酸合成酶还 原酶基因（MTRR)上的3个SNP位点多态性的方法都是需要从人全血或口腔上皮组织中 抽提人基因组DNA，然后在荧光定量PCR仪上，利用荧光探针或荧光染料法进行荧光定量 PCR，根据荧光信号强弱或溶解曲线来判断突变类型。这些方法虽然可以做到当天出结果， 但是不适合国内二三线城市的医院或妇幼保健院内检测。原因如下： 1、 荧光定量PCR仪价格昂贵，国产仪器售价也超过三十万元，不是所有医院都能配备； 2、 试剂盒在不同厂家或不同型号的荧光定量PCR仪上判读方法或结果不一致，需要做 预实验或测序验证后才能大规模检测； 3、 需要抽提基因组DNA，额外增加检测人员工作量及检测成本，并且容易造成样本污 染。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的之一是提供一种无需抽提人基因组DNA，而从全血直接PCR，无需昂 贵的荧光定量PCR仪，检测5, 10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因上rsl801133号SNP位点的 血液直接PCR法检测叶酸代谢相关基因多态性的引物。
[0010] 本发明的目的之二是提供一种无需抽提人基因组DNA，而从全血直接PCR，无需昂 贵的荧光定量PCR仪，检测5, 10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因上rsl801131号SNP位点的 血液直接PCR法检测叶酸代谢相关基因多态性的引物。
[0011] 本发明的目的之三是提供一种无需抽提人基因组DNA，而从全血直接PCR，无需昂 贵的荧光定量PCR仪，检测甲硫氨酸合成酶还原酶基因上rsl801394号SNP位点的血液直 接PCR法检测叶酸代谢相关基因多态性的引物。
[0012] 本发明的目的之四是提供一种无需抽提人基因组DNA，而从全血直接PCR，无需昂 贵的荧光定量PCR仪，同时检测5, 10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因上rsl801133号SNP位 点、5, 10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因上rsl801131号SNP和甲硫氨酸合成酶还原酶基 因上rsl801394号SNP位点的血液直接PCR法检测叶酸代谢相关基因多态性的引物组。
[0013] 本发明的目的之五是提供一种无需抽提人基因组DNA，而从全血直接PCR，无需昂 贵的荧光定量PCR仪，同时检测5, 10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因上rsl801133号SNP位 点、5, 10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因上rsl801131号SNP和甲硫氨酸合成酶还原酶基 因上rsl801394号SNP位点的、通过PCR产物测序来判断的血液直接PCR法检测叶酸代谢 相关基因多态性的试剂盒。
[0014] 本发明的目的之六是提供一种无需抽提人基因组DNA，而从全血直接PCR，无需昂 贵的荧光定量PCR仪，同时检测5, 10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因上rsl801133号SNP位 点、5, 10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因上rsl801131号SNP和甲硫氨酸合成酶还原酶基 因上rsl801394号SNP位点的、通过PCR产物测序来判断的血液直接PCR法检测叶酸代谢 相关基因多态性的检测方法。
[0015] 本发明的第一技术目的是通过以下技术方案得以实现的： 血液直接PCR法检测叶酸代谢相关基因多态性的引物，其包括以下引物对： (1)正向引物 MTRR-PF，其核苷酸序列 SEQ ID N0.1: atgccttgaagtgatgag; 反向引物 MTRR-PR，其核苷酸序列 SEQ ID N0.2: actgtaacggctctaacc;和 / 或 (2 )由正向引物MTRR-PF或反向引物MTRR-PR的核苷酸序列经增加、缺失或替换单个核 苷酸得到的引物； 上述引物对应的目的基因为5, 10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因，以该基因为模板扩增 所得DNA片段包含rsl801133号SNP位点。
[0016] 本发明设定并合成特定的所述特异性引物，可检测5, 10-亚甲基四氢叶酸还原酶 基因上rsl801133号SNP位点。
[0017] 本发明的第二技术目的是通过以下技术方案得以实现的： 血液直接PCR法检测叶酸代谢相关基因多态性的引物，其包括以下引物对： (1)正向引物 MTHFR-677PF，其核苷酸序列 SEQ ID NO. 3: AGGACAGTGTGGGAGTTTGG; 反向引物MTHFR-677PR，其核苷酸序列 SEQ ID NO. 4: GAAAAGCTGCGTGATGATGA;和 / 或 (2 )由正向引物MTHFR-677PF或反向引物MTHFR-677PR的核苷酸序列经增加、缺失或替 换单个核苷酸得到的引物； 上述引物对应的目的基因为5, 10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因，以该基因为模板扩增 所得DNA片段包含rsl801131号SNP位点。
[0018] 本发明设定并合成特定的所述特异性引物，可检