测5, 10-亚甲基四氢叶酸还原酶 基因上rsl801131号SNP位点。
[0019] 本发明的第三技术目的是通过以下技术方案得以实现的： 血液直接PCR法检测叶酸代谢相关基因多态性的引物，其包括以下引物对： (1) 正向引物MTHFR-1298PF，其核苷酸序列SEQ ID NO. 5: CCAGACCAAAGAGTTACATCTACCG ； 反向引物 MTHFR-1298PR，其核苷酸序列 SEQ ID N0.6: CTTACCCTTCTCCCTTTGCCA;和 / 或 (2 )由正向引物MTHFR-1298PF或反向引物MTHFR-1298PR的核苷酸序列经增加、缺失或 替换单个核苷酸得到的引物； 上述引物对应的目的基因为甲硫氨酸合成酶还原酶基因，以该基因为模板扩增所得 DNA片段包含rsl801394号SNP位点。
[0020] 本发明设定并合成特定的所述特异性引物，可检测甲硫氨酸合成酶还原酶基因上 rsl801394 号 SNP 位点。
[0021] 本发明的第四技术目的是通过以下技术方案得以实现的： 血液直接PCR法检测叶酸代谢相关基因多态性的引物组，所述引物组包含以下引物 对： 1) 正向引物 MTRR-PF，其核苷酸序列 SEQ ID NO. I: atgccttgaagtgatgag; 反向引物 MTRR-PR，其核苷酸序列 SEQ ID NO. 2: actgtaacggctctaacc; 2) 正向引物 MTHFR-677PF，其核苷酸序列 SEQ ID NO. 3: AGGACAGTGTGGGAGTTTGG; 反向引物 MTHFR-677PR，其核苷酸序列 SEQ ID N0.4: GAAAAGCTGCGTGATGATGA; 3) 正向引物MTHFR-1298PF，其核苷酸序列SEQ ID NO. 5: CCAGACCAAAGAGTTACATCTACCG ； 反向引物 MTHFR-1298PR，其核苷酸序列 SEQ ID N0.6: CTTACCCTTCTCCCTTTGCCA。
[0022] 5, 10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因上rsl801133号SNP位点、5, 10-亚甲基四 氢叶酸还原酶基因上rsl801131号SNP和甲硫氨酸合成酶还原酶基因上rsl801394号 SNP位点是目前已公认的会引起叶酸代谢障碍的基因突变。这三个基因多态性位点分别是 MTRR (A66G)，MTHFR (C677T)，MTHFR (A1298C)。本发明无需抽提人基因组DNA，而从全血直接 PCR，无需昂贵的荧光定量PCR仪，通过所述引物可同时检测5, 10-亚甲基四氢叶酸还原酶 基因上^1801133号3咿位点、5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因上^1801131号3咿 和甲硫氨酸合成酶还原酶基因上rsl801394号SNP位点。
[0023] 叶酸代谢有关基因多态性
【主权项】
1. 血液直接PCR法检测叶酸代谢相关基因多态性的引物，其特征在于包括以下引物 对： (1)正向引物MTRR-PF，其核苷酸序列SEQIDNO.l:atgccttgaagtgatgag; 反向引物MTRR-PR，其核苷酸序列SEQIDN0.2:actgtaacggctctaacc;和 / 或 (2 )由正向引物MTRR-PF或反向引物MTRR-PR的核苷酸序列经增加、缺失或替换单个核 苷酸得到的引物； 上述引物对应的目的基因为5, 10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因，以该基因为模板扩增 所得DNA片段包含rsl801133号SNP位点。
2. 血液直接PCR法检测叶酸代谢相关基因多态性的引物，其特征在于包括以下引物 对： (1)正向引物MTHFR-677PF，其核苷酸序列SEQIDNO. 3:AGGACAGTGTGGGAGTTTGG; 反向引物MTHFR-677PR，其核苷酸序列SEQIDNO. 4:GAAAAGCTGCGTGATGATGA;和 / 或 (2 )由正向引物MTHFR-677PF或反向引物MTHFR-677PR的核苷酸序列经增加、缺失或替 换单个核苷酸得到的引物； 上述引物对应的目的基因为5, 10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因，以该基因为模板扩增 所得DNA片段包含rsl801131号SNP位点。
3. 血液直接PCR法检测叶酸代谢相关基因多态性的引物，其特征在于包括以下引物 对： (1) 正向引物MTHFR-1298PF，其核苷酸序列SEQIDNO. 5:CCAGACCAAAGAGTTACATCTACCG； 反向引物MTHFR-1298PR，其核苷酸序列SEQIDN0.6:CTTACCCTTCTCCCTTTGCCA;和 / 或 (2 )由正向引物MTHFR-1298PF或反向引物MTHFR-1298PR的核苷酸序列经增加、缺失或 替换单个核苷酸得到的引物； 上述引物对应的目的基因为甲硫氨酸合成酶还原酶基因，以该基因为模板扩增所得DNA片段包含rsl801394号SNP位点。
4. 血液直接PCR法检测叶酸代谢相关基因多态性的引物组，其特征在于：所述引物组 包含以下引物对： 1) 正向引物MTRR-PF，其核苷酸序列SEQIDN0.1:atgccttgaagtgatgag; 反向引物MTRR-PR，其核苷酸序列SEQIDN0.2:actgtaacggctctaacc; 2) 正向引物MTHFR-677PF，其核苷酸序列SEQIDNO. 3:AGGACAGTGTGGGAGTTTGG; 反向引物MTHFR-677PR，其核苷酸序列SEQIDN0.4:GAAAAGCTGCGTGATGATGA; 3) 正向引物MTHFR-1298PF，其核苷酸序列SEQIDNO. 5: CCAGACCAAAGAGTTACATCTACCG； 反向引物MTHFR-1298PR，其核苷酸序列SEQIDN0.6:CTTACCCTTCTCCCTTTGCCA。
5. 血液直接PCR法检测叶酸代谢相关基因多态性的试剂盒，其特征在于：试剂盒包括 2XTaqMasterMix,权利要求4所述的引物组和去离子水ddH20。
6. 根据权利要求5所述的血液直接PCR法检测叶酸代谢相关基因多态性的试剂盒， 其特征在于：所述 2XTaqMasterMix的配方是：0? 04-0. 06U/mlHaemoTaq酶、0? 4-0. 6mM dNTP，50-70mMTricine，4-6mM(NH4)2S04,2.5-4.5mMMgCl2,4-7% 甘油，pH8-9 (25。〇， 9〇-110ng/mlT4 32gene。
7. 根据权利要求5所述的血液直接PCR法检测叶酸代谢相关基因多态性的试剂盒， 其特征在于：所述2XTaqMasterMix的配方是：0. 05U/mlHaemoTaq酶、0. 5mMdNTP，60mM Tricine，5mM(NH4)2S04,3.5mMMgCl2,6% 甘油，pH8.7 (25°C)，100ng/mlT4 32gene。
8. 血液直接PCR法检测叶酸代谢相关基因多态性的检测方法，其特征在于：所述方法 包括利用权利要求5-7任一项所述试剂盒进行PCR反应，将所得的PCR反应产物测序，在测 序图上分析突变位点。
9. 根据权利要求8所述的血液直接PCR法检测叶酸代谢相关基因多态性的检测方法， 其特征在于：所述方法包括配制PCR反应体系，每个样本共计3个反应，具体为： MTRR(A66G)突变：
10. 根据权利要求8所述的血液直接PCR法检测叶酸代谢相关基因多态性的检测方 法，其特征在于：所述方法包括PCR反应具体程序的设置，具体为：
【专利摘要】本发明涉及分子生物学检测，尤其涉及一种血液直接PCR法检测叶酸代谢相关基因多态性的引物、引物组、试剂盒及检测方法。引物组包含以下引物对：1)正向引物MTRR-PF，其核苷酸序列SEQ？ID？NO.1:atgccttgaagtgatgag；反向引物MTRR-PR，其核苷酸序列SEQ？ID？NO.2:actgtaacggctctaacc;2)正向引物MTHFR-677PF；反向引物MTHFR-677PR;3)正向引物MTHFR-1298PF；反向引物MTHFR-1298PR。本发明无需抽提人基因组DNA即可判断检测基因多态性。
【IPC分类】C12Q1-68, C12N15-11
【公开号】CN104561296
【申请号】CN201410839688
【发明人】蔡丽君, 谢彩霞
【申请人】湖州鼎晶医学检验所有限公司
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年12月30日