中期因子mRNA在肺癌患者外周血中的表达及其应用
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及中期因子mRNA在癌症诊断中的应用，尤其是外周血中中期因子mRNA 用于非小细胞肺癌鉴别诊断的应用。
【背景技术】
[0002] 肺癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率均位于恶性肿瘤之首。非 小细胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer，NSCLC)约占其80%，近些年疗效虽有提高， 但长期生存率仍较偏低，绝大多数患者确诊时已是癌症晚期，只能采取姑息性治疗，预后较 差。
[0003] 中期因子（midkine，MK)是一种分泌型肝素结合生长因子，为低分子量的蛋白质。 MK大量表达于妊娠中期并在妊娠的发展中起着重要的作用。在成人，MK被限制在一定的组 织中表达。然而，在肿瘤发生，炎症和组织细胞修复的过程中，MK的表达明显增强。近年 发现MK在多种实体瘤中过表达，在癌前病变和肿瘤潜伏期也呈高表达，因此MK可能成为 新的肿瘤标记物.MK与恶性肿瘤的关系不十分清楚，但一些实验已证实MK参与肿瘤生长、 血管生成、多药耐药形成等过程.应用MK反义寡脱氧核糖核苷酸（MKasODN)或MK启动子 进行基因治疗，可能成为基因治疗的新靶点.
[0004] 本发明拟通过建立外周血荧光定量PCR检测MKmRNA的表达方法，比较和分析了外 周血中MK mRNA的表达水平在不同人群（NSCLC患者，LEL患者，正常体检者）中的表达差 异及与NSCLC的临床病理特征的关系，并对其作为NSCLC的诊断标志物的可行性进行了探 讨。
[0005] 在实施过程中，本发明人成功建立了外周血中MK mRNA的荧光定量PCR检测方法， 发现外周血中MK mRNA的表达水平在NSCLC患者，LEL患者，正常体检者间存在显著性差异， 且其高表达水平与NSCLC的临床分期、淋巴结转移，细胞分化程度有显著的相关性。在鉴别 诊断NSCLC患者和正常人时，ROC曲线下面积AUC值为0. 814 (95% CI = 0. 738 to 0. 894)， 在鉴别诊断NSCLC患者和LEL患者时，ROC曲线下面积AUC值为0. 759(95% Cl = 0. 673 to 0. 846)，将cut-off值设在0. 0063时，MKmRNA鉴别诊断NSCLC患者与LEL患者和鉴别 诊断NSCLC患者和正常人的敏感性和特异性分别为57. 47%和93. 33% ;以及56. 32%和 93. 33%。此外，Logistic回归分析认为，外周血中MK mRNA的高水平表达是NSCLC发生的 独立危险因素。
【发明内容】
[0006] 本发明通过建立外周血MKmRNA的Taqman荧光定量PCR法检测方法，比较NSCLC 患者、LEL患者、健康体检者外周血中MK mRNA的表达水平，并分析其表达水平与NSCLC临 床病理特征的相关性，通过ROC曲线和多元Logistic回归分析，发现NSCLC患者外周血中 MK mRNA表达可以作为诊断NSCLC的肿瘤标志物。
[0007] 本发明建立了敏感、特异、稳定的NSCLC外周血MK mRNATaqman探针real time PCR检测方法：
[0008] (1)培养肺癌细胞A549,抽提总RNA，合成cDNA，
[0009] (2)设计PCR扩增引物，扩增获取目的基因 MK和内参基因 GAPDH的扩增片段；
[0010] MK 引物：
[0011] MK-For : 5 ' -CGCGGATCCATGCAGCACCGAGGCTTC-3 '
[0012] MK-Rev :5' -CCCAAGCTTCTAGTCCTTTCCCTTCCCTTTC-3'
[0013] GAPDH引物序列：
[0014] GAPDH-For :5' -CCGGAATTCCTTCGCTCTCTGCTCCTCCTG-3'
[0015] GAPDH-Rev :5' -CCGCTCGAGCTCTTCCTCTTGTGCTCTTGCTG-3'
[0016] (3)PCR片段转化、链接、筛选、测序，构建质粒pET28a - MK，pET28a - GAPDH ;
[0017] (4)设计 Real-Time PCR 引物探针
[0018] MK引物及探针：
[0019] MK-For :5, -CATCACACGCACCCCAGTT-3'
[0020] MK-Probe :5' -CTTGCAGTCGGCTCCAAACTCCTTCTT-3'
[0021] MK-ReV : 5 ' ATTGCGGCGTGGGTTTC-3 '
[0022] GAPDH引物及探针：
[0023] GAPDH-For :5' -CTTTACCAGAGTTAAAAGCAGCCC-3'
[0024] GAPDH-Probe :5' -CCAAATCCGTTGACTCCGACCTTCA-3'
[0025] GAPDH-Rev :5' -CCAGCCGAGCCACAT-3'
[0026] e)以梯度稀释质粒PCR扩增制备标准曲线，建立Taqman探针real time PCR检测 方法
[0027] 反应体系建立：
[0028]
【主权项】
1. 一种用于诊断NSCLC的试剂盒，其使用过程包括检测外周血中中期因子mRNA的步 骤。
2. -种MK和GAPDH基因的引物探针，其特征在于其序列如下： MK引物及探针： MK-For :5' - CATCACACGCACCCCAGTT-3' MK-Probe :5' -CTTGCAGTCGGCTCCAAACTCCTTCTT-3' MK-Rev :5' ATTGCGGCGTGGGTTTC-3' GAPDH引物及探针： GAPDH-For :5' -CTTTACCAGAGTTAAAAGCAGCCC-3' GAPDH-Probe :5' -CCAAATCCGTTGACTCCGACCTTCA-3' GAPDH-Rev :5' -CCAGCCGAGCCACAT-3'。
3. -种试剂盒，包括权利要求2所述的引物及探针。
【专利摘要】本发明公开了一种外周血中中期因子(midkine,MK)mRNA的荧光定量PCR检测方法。本发明比较了非小细胞肺癌(NSCLC)患者、肺良性疾病患者(LEL)、健康体检者(Healthy)外周血中MK？mRNA的表达水平，并分析了其表达水平与NSCLC临床病理特征的相关性，并对外周血中MK？mRNA的表达作为NSCLC鉴别诊断标志物的可行性进行了探讨，结果显示，外周血中MK？mRNA的表达水平在NSCLC患者，LEL患者，正常体检者间存在显著性差异，且其高表达水平与NSCLC的临床分期、淋巴结转移，细胞分化程度有显著的相关性。因此，外周血中MK？mRNA的检测可以用于鉴别诊断NSCLC的高效检测。
【IPC分类】C12Q1-68, C12N15-11
【公开号】CN104561298
【申请号】CN201410841608
【发明人】马志红, 李丽琴, 黄惠莲, 李静, 戴利成
【申请人】湖州市中心医院
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年12月29日