一种用于鉴定小麦籽粒过氧化物酶活性的分子标记及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于鉴定小麦籽粒过氧化物酶活性的分 子标记及其应用。
【背景技术】
[0002] 面粉及其制品颜色是小麦品质遗传改良的重要内容,颜色已成为制约我国面粉及 其制品品质的重要因素。过氧化物酶（Peroxidase，P0D)活性是影响面制品颜色和加工品 质的主要因素，在小麦制品加工和贮存期间引起面粉和面制品失色、变白。POD主要通过催 化含有羧基、酮基的化合物与酚类、芳香族等不饱和双键释放出分子氧，释放出的分子氧能 将面粉及面制品中色素分子的共轭双键氧化为单键，从而对面粉颜色起到漂白作用。因此， 通过现代分子生物学手段研究小麦籽粒POD活性基因的遗传基础、克隆POD基因、发掘优异 等位变异、开发其功能标记并培育POD活性高的小麦品种对我国小麦品质改良具有重要意 义。
[0003] POD活性主要受基因型影响，小麦籽粒POD活性主效QTL还不明确。虽然环境因 素对POD活性有一定影响，但主要受遗传因素影响。在禾本科作物中，普通小麦具有最高的 POD活性，其活性分别是燕麦、水稻和玉米的3倍、6倍和7倍。研究表明，普通小麦POD活 性显著高于（P〈〇. 05)硬粒小麦。在普通小麦的不同品种间POD活性可相差3-10倍。因此 通过遗传和常规育种途径改良POD活性，并利用分子标记辅助选择快速改良我国小麦面制 品颜色、提高小麦附加值具有重要的理论意义和经济价值。
【发明内容】
[0004] 本发明的一个目的是提供一种鉴定小麦籽粒过氧化物酶活性的成套引物。
[0005] 本发明提供的鉴定小麦籽粒过氧化物酶活性的成套引物由如下（1)和（2)所示的 引物对组成：
[0006] (1)为由SEQ ID No. 1所示的单链DNA和SEQ ID No. 2所示的单链DNA组成的引 物对1 ;
[0007] (2)为由SEQ ID No. 3所示的单链DNA和SEQ ID No. 4所示的单链DNA组成的引 物对2。
[0008] 本发明的另一个目的是提供一种鉴定小麦籽粒过氧化物酶活性的PCR试剂。
[0009] 本发明提供的鉴定小麦籽粒过氧化物酶活性的PCR试剂由PCR试剂1和PCR试剂 2组成。
[0010] 上述PCR试剂中，所述PCR试剂1包括上述成套引物中的引物对1 ;所述PCR试剂 2包括上述成套引物中的引物对2。
[0011] 上述PCR试剂中，所述成套引物中各个引物对独立包装，各条引物独立包装。
[0012] 上述PCR试剂中，所述引物对1和所述引物对2的各条引物在其对应的所述PCR 试剂中的终浓度均为KTmol/L。
[0013] 本发明还有一个目的是提供含有上述成套引物或上述PCR试剂的试剂盒。
[0014] 上述的成套引物或上述的PCR试剂或上述的试剂盒在检测或辅助检测小麦籽粒 的POD活性高低中的应用也属于本发明的保护范围。
[0015] 上述的成套引物或上述的PCR试剂或上述的试剂盒在检测或辅助检测待测小麦 为高POD活性小麦或低POD活性小麦中的应用也属于本发明的保护范围。
[0016] 上述应用中，所述高POD活性小麦中的POD活性小于等于506. 5U minV;所述低 POD活性小麦中的POD活性大于等于518. 5U HiirT1 g_S小麦的POD活性通过检测小麦籽粒的 POD活性体现。
[0017] 上述的成套引物或上述的PCR试剂或上述的试剂盒在如下（1)-(7)中至少一种中 的应用也属于本发明的保护范围。
[0018] (1)鉴定或辅助鉴定待测小麦POD活性高低中的应用；
[0019] (2)鉴定或辅助鉴定低POD活性小麦品种；
[0020] (3)鉴定或辅助鉴定高POD活性小麦品种；
[0021] (4)比较或辅助比较不同待测小麦品种的POD活性；
[0022] (5)鉴定或辅助鉴定待测小麦含有TaPod-Dla基因还是TaPod-Dlb基因；
[0023] (6)鉴定或辅助鉴定含有TaPod-Dla基因的小麦品种；
[0024] (7)鉴定或辅助鉴定含有TaPod-Dlb基因的小麦品种。
[0025] 本发明还有一个目的是提供一种检测或辅助检测待测小麦为高POD活性小麦还 是低POD活性小麦的方法。
[0026] 本发明提供的检测或辅助检测待测小麦为高POD活性小麦还是低POD活性小麦的 方法包括如下步骤：
[0027] 用上述成套引物中的引物对1和引物对2分别对待测小麦的基因组DNA进行PCR 扩增，得到各自引物对对应的PCR扩增产物；检测所述PCR扩增产物；
[0028] 若所述引物对1的PCR扩增产物含有大小为291bp的片段，且所述引物对2的PCR 扩增产物不含有大小为766bp的片段，则所述待测小麦为或候选为低POD活性小麦；
[0029] 若所述引物对2的PCR扩增产物含有大小为766bp的片段，且所述引物对1的PCR 扩增产物不含有大小为291bp的片段，则所述待测小麦为或侯选为高POD活性小麦。
[0030] 上述方法中，所述高POD活性小麦中的POD活性小于等于506. 5U HIirT1g4;所述低 POD活性小麦中的POD活性大于等于518. 5U HiirT1g'
[0031] 上述方法中，所述PCR扩增的退火温度为59°C。
[0032] 本发明还有一个目的是提供一种检测或辅助检测待测小麦含有TaPod-Dla基因 还是TaPod -Dlb基因的方法。
[0033] 本发明提供的检测或辅助检测待测小麦含有TaPod-Dla基因还是TaPod-Dlb基因 的方法包括如下步骤：
[0034] 用上述成套引物中的引物对1和引物对2分别对待测小麦的基因组DNA进行PCR 扩增，得到各自引物对对应的PCR扩增产物；检测所述PCR扩增产物；
[0035] 若所述引物对1的PCR扩增产物含有大小为291bp的片段，且所述引物对2的PCR 扩增产物不含有大小为766bp的片段，则待测小麦品种含有或候选含有TaPod-Dla基因；
[0036] 若所述引物对2的PCR扩增产物含有大小为766bp的片段，且所述引物对1的PCR 扩增产物不含有大小为291bp的片段，则待测小麦品种含有或候选含有TaPod-Dlb基因。
[0037] 本发明还有一个目的是提供一种培育低POD活性小麦的方法。
[0038] 本发明提供的培育低POD活性小麦的方法包括如下步骤：以小麦A为亲本进行育 种；
[0039] 所述小麦A满足如下条件的小麦：用上述成套引物中的引物对1和引物对2分别 对所述小麦A的基因组DNA进行PCR扩增，所述引物对1的PCR扩增产物含有大小为291bp 的片段，且所述引物对2的PCR扩增产物不含有大小为766bp的片段；
[0040] 所述低POD活性小麦中的POD活性大于等于518. 5U mirTY1。
[0041] 本发明的最后一个目的是提供一种培育高POD活性小麦的方法。
[0042] 本发明提供的培育高POD活性小麦的方法包括如下步骤：以小麦A为亲本进行育 种；
[0043] 所述小麦A满足如下条件的小麦：用上述成套引物中的引物对1和引物对2分别 对所述小麦A的基因组DNA进行PCR扩增，所述引物对2的PCR扩增产物含有大小为766bp 的片段，且所述引物对1的PCR扩增产物不含有大小为291bp的片段；
[0044] 所述高POD活性小麦中的POD活性小于等于506. 5U mir^g'
[0045] 上文中，所述待测小麦具体可为表1中的至少一种小麦。
[0046] 通过实验证明：本发明的分子标记可以快速鉴定出TaPod-Dla和TaPod-Dlb等位 变异情况及其POD活性的高低，运用于本发明的分子标记能快速筛选出具有较高POD活性 的小麦品种（材料），不仅加速优质小麦新品种的育成步伐，而且对利用分子标记辅助选择 高POD活性小麦品种具有重要的理论意义和经济价值。
【附图说明】
[0047] 图1为部分样本的电泳图。
【具体实施方式】
[0048] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0049] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0050] 实施例1、鉴定小麦籽粒过氧化物酶（Peroxidase, P0D)活性的方法
[0051] 一、鉴定小麦籽粒过氧化物酶活性的分子标记
[0052] 1、小麦中TaPod-Dl基因存在的两种等位变异形式：一种如序列表的序列5中自 5'端第35-1180位核苷酸分子所示（命名为等位基因 TaPod-Dla);另一种如序列表的序列 6中自5'端第35-1180位核苷酸分子所示（命名为TaPod-Dlb)。
[0053] 2、基于TaPod-Dl基因的两种等位变异形式设计特异引物对1和引物对2如下：
[0054] 引物对1的上游引物（序列表的序列1) :5' -ACGGGAGACGACGAGAAGCAAAG-3' ；
[0055] 引物对1的下游引物（序列表的序列2) :5' -TCGTGGAAGTGTAGGCGAAGA-3' ；
[0056] 弓丨物对2的上游引物（序列表的序列3) :5' -GTGGCGCAGGGCCTGTCA-3' ；
[0057] 引物对2的下游引物（序列表的序列4) :5' -GTTGTCGAACACGTTGGGGGA-3'。
[0058] 二、鉴定小麦籽粒过氧化物酶活性的方法
[0059] I、提取待测小麦籽粒的基因组DNA
[0060] 2、以上述获得的基因组DNA为模板，分别采用步骤一中的引物对1和引物对2进 行PCR扩增，得到2种PCR扩增产物；
[0061] PCR 扩增的反应体系：模板 DNA 约 80ng，rTaq 酶（Takara，code :DX100B)0.2y 1， GC buffer I 10 μ I(Takara, code ：DRR20GC I), dNTP(Takara, code ：D4030RA,2. 5mM each)2y I,上游引物和下游引物各2pmol,用无菌超纯水补充反应体系至20μ I ;
[0062] PCR扩增的反应程序：94°C预变性5min ;94°C变性lmin、59°C复性lmin、72°C延伸 lmin，共35个循环；最后72°C延伸8min ;8°C保温。将得到的PCR扩增产物分别进行测序。
[0063] 3、定义小麦籽粒过氧化物酶（POD)活性：POD活性小于等于506. 5U InirT1g-1时，表 明该小麦籽粒为低POD活性小麦；当POD活性大于等于518. 5U HiirT1 g+