专利名称：一种酶解小麦蛋白制备小麦蛋白源阿片活性肽的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用蛋白酶酶解制备小麦蛋白源阿片活性肽的方法，属于小麦蛋
白深加工技术领域。
背景技术：
小麦面筋蛋白俗称谷朊粉，是小麦淀粉生产的副产品，目前主要用于食品与饲料 工业中，如作为面粉品质改良剂，螃蟹、甲鱼等的饲料粘结剂，营养添加剂等。随着面筋产量 的持续增大，其传统市场已趋饱和，并造成过剩。因此开发小麦面筋蛋白的新用途势在必 行。 食物蛋白源生物活性肽是现代营养学及食品学研究的热点和极具发展前景的功 能因子，近年来受到广泛重视。目前已从各种食物蛋白的不同酶解产物中分离鉴定出阿片 肽、血管紧张素转化酶抑制肽(降压肽)、免疫调节肽、抗菌肽、抗血栓肽、矿物元素吸收促 进肽、降胆固醇肽等。这些活性肽的组成氨基酸并不一定是必需氨基酸，这使得那些原本 认为生物价不高的蛋白质资源能够得到更充分地利用，成为能更好满足人类保健需要的基 料。 阿片肽是一类通过与阿片受体结合而发挥阿片样生理作用的小分子生物活性肽， 具有抗腹泻，促进摄食，镇痛，镇静，调节睡眠，缓解压力与紧张，抑制胃肠道运动和消化液 的分泌，促进电解质的吸收，调节内分泌，抑制细胞分裂和分化，调节免疫功能，影响生殖与 泌乳，调节心血管系统等许多生理功能，而且其毒性远较吗啡小，是一类有前途的安全有效 的治疗药物。因此，阿片肽在医药及动物生产领域具有非常广阔的应用前景。
阿片肽分为内源性阿片肽和外源性阿片肽两种。目前研究较多的外源性阿片肽主 要是来源于食物中蛋白质水解后产生的小肽片段，它们同内源性阿片肽(E0P)或吗啡类药 物一样具有阿片活性，能参与调节动物的生理活动。外源阿片肽广泛存在于食物蛋白质序 列中，如小麦、大豆、大米、牛奶、血等蛋白序列中含有许多具有阿片活性的肽段，这些食物 在消化过程中释放出阿片肽，并可能被小肠完整吸收。它们可剌激胰岛素和消化道生长抑 素的分泌、调节动物行为、促进肠道吸收水分和电解质、调节消化道运动、剌激摄食、抑制呼 吸和调整睡眠模式等。 这类外源阿片肽类最早是在酪蛋白酶解产物中被发现的，也是目前研究最深入的 一类。1979年，Brantl等首先报道豚鼠在饲喂一种酪蛋白酶解制剂时，回肠纵行肌毛细血 管中存在一种呈阿片肽活性的物质，命名为P _酪啡肽-7(13 -Casomorphin-7, P -CM-7)， 它是含有7个氨基酸残基的寡肽(Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile)，它与y型受体具有良 好的亲和力，并呈现出阿片肽类所具有的特征，如依赖性、呼吸抑制性等。之后又分离得到 P -CM-7的前体P -CM-ll (Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile-Pro-Asn-Ser-Leu)，在多种动 物的乳蛋白中具有保守性。几种肽链较短的e-CM均是十一肽自羧基端水解不同数目的氨 基酸残基后的产物，它在阿片肽受体分析中显示很高的亲和性。这种肽被认为可能直接作 用于消化道中的阿片肽受体以影响胃肠道的运动或者作为胃肠道激素的外源性调节剂，也
3可能在小肠刷状缘降解成更小的疏水性阿片肽，穿过肠粘膜进入外周血液，再透过血脑屏 障与脑中的阿片肽受体结合，即使是成年人在大量饮用牛奶后，其小肠内容物中也能检测 到显著量的这种阿片肽的免疫反应物。 近些年来，研究者对酶法增溶小麦面筋蛋白进行了大量研究，面筋蛋白的溶解性 直接影响着其起泡和乳化等功能特性。但对小麦面筋蛋白源生物活性肽的研究报道较少， 尤其是对于小麦蛋白源阿片肽的制备及其性质还未见报道。
发明内容
本发明提供了一种通过酶水解小麦蛋白制备阿片活性肽的工艺，获得的肽含量 高，阿片活性高，促进了谷朊粉的综合利用。 本发明的技术方案一种酶法制取小麦蛋白源阿片活性肽的方法，所述方法步骤 为 (1)配制小麦蛋白浆料以小麦蛋白为原料，加水调至小麦蛋白质量浓度为 5% -6% ; (2)第一步酶解调整pH值为1.5 2.0，温度为36 38t:，添加胃蛋白酶酶解， 加酶量为小麦蛋白重量的1.0% 1.5%，酶解时间9 2处； (3)第二步酶解再调节pH值为8. 3 8. 7，添加胰蛋白酶在温度46 48"酶解
或添加胰酶在36 38t:酶解，加酶量为小麦蛋白重量的0. 5% 1. 0%，酶解4 6h ; (4)后处理酶解完毕调节pH 7. 0 7. 2，灭酶，冷却，3000rpm离心20min，取上清
液经活性炭吸附脱色，3000Da超滤膜分离，干燥得到小麦蛋白源阿片活性肽粉。 所采用小麦蛋白原料为谷朊粉或者由小麦粉提取制备的小麦蛋白，其中蛋白质干
基含量不低于75%。 离体豚鼠回肠是公认的P， k阿片受体分布组织，是常用的利用外周神经研究中 枢神经系统阿片类物质作用的工具。本发明采用豚鼠回肠法测定小麦活性肽的阿片活性， 结果表明制备所得的小麦蛋白源阿片活性肽具有显著的阿片活性，而原料小麦蛋白则不具 有阿片活性。根据文献报道及实验结果，确定ICs。值小于3mg/ml即认为样品具有显著的阿 片活性，IC5。值大于50mg/ml即认为样品不具有阿片活性。 在相同试验条件下对吗啡的阿片活性进行了测量，其IC5。值为0.05mg/mL。所制 备的小麦蛋白源阿片肽的ICs。值，与吗啡相比要高一些。这主要是由于小麦蛋白经过酶解 之后得到的肽是一种混合物，鉴于小麦蛋白活性肽粉的营养补充和保健作用，以及进一步 分离纯化得到小麦蛋白源阿片肽纯品的成本等问题，本发明仅通过3000Da超滤膜对小麦 蛋白源阿片肽进行初步富集。 由于阿片肽具有镇痛，镇静，促进摄食，抑制胃肠道运动和消化液的分泌，调节内 分泌，调节免疫功能，影响生殖与泌乳，调节心血管系统等许多生理功能，故可在此基础上 进一步尝试开发生产食品添加剂，将小麦蛋白源阿片活性肽作为功能因子添加到保健食品 中。还可应用到动物饲料工业中，从而提高畜禽奶产量和生长效率，这对促进绿色饲料产业 和绿色畜禽产业的发展，提高畜禽产品品质等具有极其重大的意义。从医疗及实用意义上 看，寻找高效低毒不成瘾的镇痛药物一直是人们长期盼望的目标。 本发明的有益效果本发明通过酶解制备小麦蛋白源阿片活性肽，扩大了小麦蛋白的应用范围，旨在促进小麦蛋白的深度利用与开发，寻找有效减轻阿片类药物副作用的 新物质提供理论依据和有效途径。
图1采用本发明方法制备所得小麦蛋白源阿片活性肽的HPSEC谱图。
具体实施例方式
实施例1 :配制小麦蛋白溶液，采用豚鼠回肠法测定小麦蛋白是否具有阿片活性， 结果表明，即使加入测试槽使小麦蛋白浓度达到50mg/mL，仍未观察到抑制豚鼠回肠收縮的 现象，且和空白对照组(台氏液)没有明显差别。因此小麦蛋白不具有阿片活性。
实施例2 :采用离体豚鼠回肠来检测吗啡的阿片活性，其IC5。值为0. 05mg/mL。
实施例3 :5. Og谷朊粉分散于lOOmL水溶液中，调节pH7. 0，搅拌20min。调节温度 为5(TC，添加中性蛋白酶酶解，加酶量为谷朊粉重量的1. 0%，水解时间为12h。水解完毕， 95。C灭酶10min，冷却，3000rpm离心20min，上清液经活性炭吸附脱色，3000Da超滤膜分离 制备得到小麦肽产品。采用豚鼠回肠法检测，发现此条件所制备的小麦肽不具有阿片活性。
实施例4 :5. Og谷朊粉分散于100mL、0. 02mol/L的盐酸水溶液中，搅拌20min，采 用lmol/L的盐酸调节溶液pH为2. 0。调节溶液温度为37t:，添加胃蛋白酶酶解，加酶量为 谷朊粉重量的1. 0%，水解时间为12h。水解完毕采用lmol/LNaOH溶液调节pH为8. 5，调节 温度为47°C ，添加胰蛋白酶酶解，加酶量为小麦蛋白重量的1. 0% ，保持pH恒定酶解6h，反 应结束后调节pH为7. 0，95。C灭酶10min，冷却，3000rpm离心20min，上清液经活性炭吸附 脱色，3000Da超滤膜分离制备得到小麦活性肽产品。采用豚鼠回肠法检定表明小麦活性肽 具备阿片活性，IC5。值为1. 56±0. 58mg/mL。 实施例5 :以小麦蛋白为原料，加水调至质量百分比为5. 0% ，调整pH值为1. 5，添 加胃蛋白酶酶解，加酶量为谷朊粉重量的1.0% ;酶解温度37t:，水解时间12h。水解完毕 调节pH为8. 5，温度37t:，添加胰酶酶解，加酶量为小麦蛋白重量的0. 5X，保持pH恒定酶 解6h，酶解完毕调节pH为7. 0，灭酶，冷却，3000rpm离心20min，上清液经活性炭吸附脱色， 3000Da超滤膜分离制备得到小麦活性肽产品。采用豚鼠回肠法检定表明小麦活性肽具备显 著的阿片活性，IC5。值为1. 29±0. 38mg/mL。所得小麦阿片活性肽产品经HPSEC检测分析， 分子量主要集中于2000以下(如图1所示)。 实施例6 :豚鼠回肠(GPI)离体检定法测定小麦蛋白肽的阿片活性 台氏(Tyrode)液的配制NaCl 8g， KC1 0. 2g， CaCl2 0. 2g， NaHC03 0. lg， MgCl2
0. lg， NaH2P04 0 . 05g，葡萄糖1. Og，加蒸馏水至1000mL。 实验前动物禁食12 24h，饮水不限，取豚鼠一只，击头致死，立即剖腹，弃去近回 盲瓣10cm的部分，剪下回肠上半段，浸入台氏液中，将肠系膜沿肠壁小心剪掉，用台氏液将 肠内容物冲净，剪成2-2. 5cm长的肠段备用。将肠段固定于装有37t:台式液的恒温离体器 官实验仪中，持续供给95%的02和5% C02混合气体，经张力换能器将肠段纵肌方向收縮活 动的信号输入到LMS-2B型二道生理仪，描记收縮活动曲线。肠段在0. 8g的前负荷下温育， 每20min更换一次新鲜的台式液(37°C )，静置30min后，待肠段自发活动平稳时用微量注 射器于浴槽深处给药。药物浓度均指溶于肌槽中台氏液后的最终浓度。以累计浓度法加入
5待测样液(所制备肽粉溶解液)，记录量效关系，然后用台式液反复冲洗标本，待张力恢复正常后，再加入下一个样品。在浴槽中先后加入0. 2mL、10—7mol/L的纳洛酮，观察纳洛酮存在与否对阿片活性的影响。 用半数抑制浓度IC5。值来评价样品的阿片活性的强弱。IC5。值是指在相同实验条件下，能使离体肠段的自主收縮抑制50%的样品浓度。IC5。值越小，表明阿片活性越强。
权利要求
一种酶法制取小麦蛋白源阿片活性肽的方法，其特征在于所述方法步骤为(1)配制小麦蛋白浆料以小麦蛋白为原料，加水调至小麦蛋白质量浓度为5％-6％；(2)第一步酶解调整pH值为1.5～2.0，温度为36～38℃，添加胃蛋白酶酶解，加酶量为小麦蛋白重量的1.0％～1.5％，酶解时间9～24h；(3)第二步酶解再调节pH值为8.3～8.7，添加胰蛋白酶在温度46～48℃酶解或添加胰酶在36～38℃酶解，加酶量为小麦蛋白重量的0.5％～1.0％，酶解4～6h；(4)后处理酶解完毕调节pH 7.0～7.2，灭酶，冷却，3000rpm离心20min，取上清液经活性炭吸附脱色，3000Da超滤膜分离，干燥得到小麦蛋白源阿片活性肽粉。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所采用小麦蛋白原料为谷朊粉或者由小麦 粉提取制备的小麦蛋白，其中蛋白质干基含量不低于75%。
全文摘要
一种酶解小麦蛋白制备小麦蛋白源阿片活性肽的方法，属于小麦蛋白深加工技术领域。本发明以小麦蛋白为原料，加水调至一定的质量百分比，调节一定的温度、pH，先采用胃蛋白酶酶解，然后改变酶解条件，采用胰蛋白酶或胰酶进行酶解，水解完毕调节pH至中性，灭酶，冷却，离心，取上清液经过脱色、3000Da超滤膜分离，干燥得到小麦蛋白源阿片活性肽粉。采用豚鼠回肠法测定阿片活性表明，制备所得的小麦蛋白源活性肽具有显著的阿片活性，而原料小麦蛋白则不具有阿片活性。本发明通过酶解制备小麦蛋白源阿片活性肽，扩大了小麦蛋白的应用范围，为促进小麦蛋白的深度开发与利用提供理论依据和有效途径。
文档编号C12P21/06GK101717805SQ20091023173
公开日2010年6月2日 申请日期2009年12月1日 优先权日2009年12月1日
发明者华欲飞, 周惠明, 孔祥珍, 钱海峰 申请人:江南大学