1时，表明该小麦籽 粒为高POD活性小麦。
[0064] (1)若所述引物对1的PCR扩增产物含有大小为291bp的片段，且所述引物对2的 PCR扩增产物不含有大小为766bp的片段，则待测小麦为低POD活性小麦；
[0065] 若所述引物对2的PCR扩增产物含有大小为766bp的片段，且所述引物对1的PCR 扩增产物不含有大小为291bp的片段，则待测小麦为高POD活性小麦；
[0066] (2)若所述引物对1的PCR扩增产物含有大小为291bp的片段，且所述引物对2的 PCR扩增产物不含有大小为766bp的片段，则待测小麦含有等位基因 TaPod-Dla ;
[0067] 若所述引物对2的PCR扩增产物含有大小为766bp的片段，且所述引物对1的PCR 扩增产物不含有大小为291bp的片段，则待测小麦含有等位基因 TaPod-Dlb。
[0068] 实施例2、分子标记的验证
[0069] 实验材料：125份中国冬小麦主推品种（如表1所不），公众可从中国农业科学院 作物科学研究所的国家种质资源库获得。
[0070] 采用实施例1所述的鉴定小麦籽粒过氧化物酶活性的方法对125份中国冬小麦主 推品种进行验证。同时在河南安阳种植各个小麦品种，收获后检测小麦籽粒的POD活性，每 个小麦材料的POD活性重复检测两次，如果两次检测结果的误差超过10%，则需进行第三 次重复检测，结果取平均值。
[0071] 测定籽粒的POD活性的方法如下所示：
[0072] 1、普通小麦籽粒POD的提取
[0073] (1)精选I. 2g小麦种子，用高通量组织研磨仪（Spex 2010Geno/Grinder, US ; http://www. spexsampleprep. com)进行研磨，磨成全麦粉，称取0· 5g放入IOmL的离心管 中。
[0074] (2)加入5mL在4°C下预冷的0. IM磷酸缓冲液（pH 7.5)，放于混旋器上振荡，使缓 冲液与全麦粉充分接触，随后将装有样品的离心管冰浴下震荡2小时。
[0075] (3)以IOOOOrpm的转速，在4°C条件下离心15min。
[0076] (4)吸取上清液，即为过氧化物酶粗提物，立即放入4°C冰箱保存备用。
[0077] 2、愈创木酚紫外分光光度法测定POD活性
[0078] 本研究采用愈创木酚紫外分光光度法进行POD活性的检测。在过氧化氢（H2O 2)存 在下，POD能将愈创木酚（底物）氧化，生成的茶褐色产物在470nm处有最大的光吸收值， 故可通过470nm处的吸光度变化来测定POD的活性。POD活性检测底物为25 μ L的H2O2, 5 μ L 2%的愈创木酚和145 μ L 0. 05M的磷酸-柠檬酸缓冲液（pH 5. 0)的混合液，混匀后 立即使用，随后滴入5 μ L的POD粗酶液进行检测。同一重复内材料的POD活性检测使用同 一批次配置的底物，以避免因底物浓度误差导致的实验误差。在470nm和30°C下，应用酶 (SpectraMax Plus384, Molecular Devices, LLC, US ；http://www. moleculardevices. com)和96孔酶标板测定150s内吸光度的增加速率，间隔10s测定一次反应产物，取POD粗 酶液在50-150S的吸光度的增加值。
[0079] 单位POD活性（U)定义：每克全麦粉每分钟反应产物在470nm处的吸光度的增加 值（ΛΑ 47。）。POD 活性（U miiTY1) = ΛΑ47(ιπ?η?Χ0·2Χ102，Κ*:ΛΑ4π^ 470ηπ^^* 下50-150S内吸光度的增加值。
[0080] 各个品种小麦籽粒的POD活性检测结果如表1所示：125个中国冬小麦品种扩增 得到的PCR扩增产物按大小分为两种：一种为291bp ;另一种为766bp。部分样本的电泳 图见图1 (其中，泳道1-10样本分别对应表1中的小麦品种；泳道1 :济麦19 ;泳道2 :中麦 895 ;泳道3 :晋麦61 ;泳道4 :百农3217 ;泳道5 :藁城8901 ;泳道6 :兰考24 ;泳道7 :济麦 21 ;泳道8 :中892 ;泳道9 :良星66 ;泳道10 :烟农15)。125个小麦品种中：61个品种含有等 位基因 TaPod-Dla，P0D活性平均值为453. 6U π?η-?64个品种含有等位基因 TaPod-Dlb， POD活性平均值为569. 5U InirT1g-1;含有等位基因 TaPod-Dla的小麦品种的POD活性低于 含有等位基因 TaPod-Dlb的小麦品种的POD活性，两者具有显著差异（P〈0. 05)。
[0081] 结果表明：61个含有等位基因 TaPod-Dla的小麦品种中，52个为低POD活性品种， 即通过是否含有等位基因 TaPod-Dla辅助鉴定低POD活性小麦的准确率为85% ;64个含 有等位基因 TaPod-Dlb的小麦品种中，50个为高POD活性品种，即通过是否含有等位基因 TaPod-Dlb辅助鉴定高POD活性小麦的准确率为78%。
[0082] 表1、各个小麦品种的PCR检测结果和POD活性检测结果
[0083]
【主权项】
1. 鉴定小麦籽粒过氧化物酶活性的成套引物，由如下（1)和（2)所示的引物对组成： ⑴为由SEQ ID No. 1所示的单链DNA和SEQ ID No. 2所示的单链DNA组成的引物对 1 ; (2)为由SEQ ID No. 3所示的单链DNA和SEQ ID No. 4所示的单链DNA组成的引物对 2〇
2. 鉴定小麦籽粒过氧化物酶活性的PCR试剂，由PCR试剂1和PCR试剂2组成；所述 PCR试剂1包括权利要求1所述成套引物中的引物对1 ;所述PCR试剂2包括权利要求1所 述成套引物中的引物对2。
3. 根据权利要求2所述的PCR试剂，其特征在于：所述引物对1和所述引物对2的各 条引物在其对应的所述PCR试剂中的终浓度均为10_7mol/L。
4. 含有权利要求1所述的成套引物或权利要求2或3所述的PCR试剂的试剂盒。
5. 权利要求1所述的成套引物或权利要求2或3所述的PCR试剂或权利要求4所述的 试剂盒在检测或辅助检测小麦籽粒的POD活性高低中的应用； 或权利要求1所述的成套引物或权利要求2或3所述的PCR试剂或权利要求4所述的 试剂盒在检测或辅助检测待测小麦为高POD活性小麦或低POD活性小麦中的应用； 所述高POD活性小麦中的POD活性小于等于506. 5U InirT1g-1; 所述低POD活性小麦中的POD活性大于等于518. 5U min-Y1。
6. 权利要求1所述的成套引物或权利要求2或3所述的PCR试剂或权利要求4所述的 试剂盒在如下（1)-(7)中至少一种中的应用： (1) 鉴定或辅助鉴定待测小麦POD活性高低中的应用； (2) 鉴定或辅助鉴定低POD活性小麦品种； (3) 鉴定或辅助鉴定高POD活性小麦品种； (4) 比较或辅助比较不同待测小麦品种的POD活性； (5) 鉴定或辅助鉴定待测小麦含有TaPod-Dla基因还是TaPod-Dlb基因； (6) 鉴定或辅助鉴定含有TaPod-Dla基因的小麦品种； (7) 鉴定或辅助鉴定含有TaPod-Dlb基因的小麦品种。
7. -种检测或辅助检测待测小麦为高POD活性小麦还是低POD活性小麦的方法，包括 如下步骤： 用权利要求1所述的成套引物中的引物对1和引物对2分别对待测小麦的基因组DNA 进行PCR扩增，得到各自引物对对应的PCR扩增产物；检测所述PCR扩增产物； 若所述引物对1的PCR扩增产物含有大小为291bp的片段，且所述引物对2的PCR扩 增产物不含有大小为766bp的片段，则所述待测小麦为或候选为低POD活性小麦； 若所述引物对2的PCR扩增产物含有大小为766bp的片段，且所述引物对1的PCR扩 增产物不含有大小为291bp的片段，则所述待测小麦为或侯选为高POD活性小麦； 所述高POD活性小麦中的POD活性小于等于506. 5U InirT1g-1; 所述低POD活性小麦中的POD活性大于等于518. 5U min-Y1。
8. -种检测或辅助检测待测小麦含有TaPod-Dla基因还是TaPod-Dlb基因的方法，包 括如下步骤： 用权利要求1所述的成套引物中的引物对1和引物对2分别对待测小麦的基因组DNA 进行PCR扩增，得到各自引物对对应的PCR扩增产物；检测所述PCR扩增产物； 若所述引物对1的PCR扩增产物含有大小为291bp的片段，且所述引物对2的PCR扩 增产物不含有大小为766bp的片段，则待测小麦含有或候选含有TaPod-Dla基因； 若所述引物对2的PCR扩增产物含有大小为766bp的片段，且所述引物对1的PCR扩 增产物不含有大小为291bp的片段，则待测小麦含有或候选含有TaPod-Dlb基因。
9. 培育低POD活性小麦的方法，包括如下步骤：以小麦A为亲本进行育种； 所述小麦A满足如下条件：用权利要求1所述的成套引物中的引物对1和引物对2分别 对所述小麦A的基因组DNA进行PCR扩增，所述引物对1的PCR扩增产物含有大小为291bp 的片段，且所述引物对2的PCR扩增产物不含有大小为766bp的片段；所述低POD活性小麦 中的POD活性大于等于518. 5U η?η?。
10. 培育高POD活性小麦的方法，包括如下步骤：以小麦A为亲本进行育种； 所述小麦A满足如下条件：用权利要求1所述的成套引物中的引物对1和引物对2分别 对所述小麦A的基因组DNA进行PCR扩增，所述引物对2的PCR扩增产物含有大小为766bp 的片段，且所述引物对1的PCR扩增产物不含有大小为291bp的片段； 所述高POD活性小麦中的POD活性小于等于506. 5U HiirT1g'
【专利摘要】本发明公开了一种用于鉴定小麦籽粒过氧化物酶活性的分子标记及其应用。本发明的分子标记由如下(1)和(2)所示的引物对组成：(1)为由SEQ？ID？No.1所示的单链DNA和SEQ？ID？No.2所示的单链DNA组成的引物对1；(2)为由SEQ？ID？No.3所示的单链DNA和SEQ？ID？No.4所示的单链DNA组成的引物对2。通过实验证明：本发明的分子标记能快速鉴定TaPod-D1a和TaPod-D1b等位变异及其与小麦POD活性的相关关系，并筛选出具有较高POD活性的小麦品种，不仅加速了优质小麦新品种的育成步伐，而且对利用分子标记辅助选择高POD活性小麦品种具有重要的理论意义和经济价值。
【IPC分类】C12N15-11, A01G1-00, C12Q1-68
【公开号】CN104561299
【申请号】CN201410843177
【发明人】耿洪伟, 夏先春, 何中虎, 魏景欣
【申请人】新疆农业大学, 中国农业科学院作物科学研究所
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年12月30日