Cyp2c9*2基因多态性的检测方法以及该方法的核酸探针和试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种CYP2C9*2基因多态性的检测探针和扩增引物，属于生物技术领 域。
【背景技术】
[0002] 华法林是近几十年来广泛应用于心房颤动的血栓预防、卒中、静脉血栓栓塞症、机 械瓣植入术后抗栓治疗等领域口服抗凝药物。该药为消旋异构体，其中R型对映体和S型 对映体作用强度不同，S型的药理作用是R型的3-6倍。该药物有很强的水溶性，经胃肠道 迅速吸收，生物利用度近于100%。口服给药后90分钟达血药浓度峰值，半衰期36?42小 时。在血液循环中与血浆蛋白结合（结合率98%?99% )。储积于肝脏的两种对映异构体 通过不同途径代谢，大约90% S型华法林发生氧化代谢反应，主要被肝脏细胞色素 P450系 统的CYP2C9酶催化，少部分由CYP3A4催化。大约60% R型华法林发生氧化代谢反应，主要 被肝脏细胞色素 P450系统的CYP1A2和CYP3A4酶催化，少部分由CYP2C19催化。华法林的 量效关系受遗传和环境因素（例如药物、饮食、各种疾病状态）影响，这些因素对其吸收、药 物动力学及药效学产生影响。
[0003] 受遗传因素的影响：华法林用药的剂量反应变异性大。
[0004] 华法林在不同种族、年龄、性别人群的剂量不同。维生素 K环氧化物还原酶主要受 S型华法林抑制，而S型华法林的代谢主要由细胞色素 P450 (CYP2C9)催化。大量研究证明 细胞色素 P450(CYP2C9)和维生素 K环氧化物还原酶复合体亚单位I(VKORCl)是两个重要 的决定了华法林的代谢及抗凝效果的基因。两个基因中主要有三个位点的多态性，基因多 态性影响华法林的起始剂量和维持剂量。华法林维持剂量在不同人群中存在差异，亚洲人 剂量较低。CYP2C9*2和CYP2C9*3的基因多态性导致对S型华法林的代谢减弱，进而引起 对华法林的清除下降，半衰期延长。以上两种突变较CYP2C9*1*1患者需要更低的华法林剂 量。CYP2C9*3和VK0RC1-1639A是危险等位基因。携带此等位基因的患者需要更低的华法 林剂量，同时面对更高的出血风险。因此基因多态性影响了华法林的代谢清除和维持量。以 往研究显示VK0RC1-1639G>A和CYP2C9*2和CYP2C9*3遗传背景可以解释约50%的华法令 剂量的变异。2007年美国FDA对华法林的基因多态性增加信息提示：CYP2C9和VKORCl的 基因多态性影响了药物的清除及稳态时的药物剂量，对于存在基因多态性的患者建议华法 林起始应用较低剂量。目前CYP2C9和VKORCl基因检测已经商品化，但国内医疗机构对华 法林敏感基因检测只能使用西方的商业化产品。
[0005] 中国医学科学院阜外心血管病医院在华法林用药剂量检测技术的研究方面具有 丰富的临床数据和临床资源积累，同时这一研究也是"十二五"重大新药创制课题之一。将 研究成果转化为供临床应用的检测试剂盒和对应的用药指南，能方便准确的确定临床用药 剂量和指导医师用药，对提高心血管疾病的临床治疗效果将具有重大的价值。
[0006] 现有技术中TaqMan探针法是一种高度特异的定量PCR技术，其技术原理的核心是 利用Taq酶的5 '_3'外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。由于探针与模板是特异 性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。
[0007] 在TaqMan探针法的定量PCR反应体系中，包括一对PCR引物和一条探针。探 针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5 '端标记有报告基团 (Reporter, R)，如FAM、VIC等，3'端标记有突光淬灭基团（Quencher, Q)，如BHQ等。当探 针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR 的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5 '_3'外切酶活性就会将探针 切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。所以，每经过一个PCR 循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程。信号的强度就代表了模板 的DNA的拷贝数。
[0008] MGB探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团（NFQ)，本身不产生荧光，可以大大降低 本底信号的强度。同时探针上还连接有MGB (Minor Groove Binder)修饰基团，可以将探针 的Tm值提高KTC左右，因为为了获得同样的Tm值，MGB探针可以比普通的TaqMan探针设 计得更短，既降低了合成成本，也使得探针设计的成功率大为提高。因为在模板的DNA碱基 组成不理想的情况下，短的探针比长的更容易设计。
【发明内容】
[0009] 本发明要解决的技术问题是提供一种能有效检测CYP2C9*2基因多态性的探针， 并提供检测CYP2C9*2基因多态性的，以及用于该方法的试剂盒。
[0010] 为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
[0011] 本发明第一方面提供了 CYP2C9*2基因多态性的检测探针，其特征在于，所示检测 探针的核苷酸序列选自序列1和序列2,运用TaqMan探针技术的原理，在5'和3'端分别 具有荧光基团和淬灭基团。为了在PCR仪中能同时测量突变型探针和野生型探针的荧光信 号，突变型探针和野生型探针所连接的荧光基团所发荧光波长的峰值要求在不同的位置；
[0012] 序列 1CYP2C9*2 突变型探针 5' -aacacAgtcctcaAtgctcc-3'
[0013] 序列 2CYP2C9*2 野生型探针 5' -ttgaacacGgtcctcaatgctc-3'。
[0014] 作为荧光染料，可以使用常规的染料。荧光染料向寡核苷酸结合的方法可以使用 常规的方法。
[0015] 本发明的探针'两端都可以用荧光染料标记。优选是探针的5'端标记荧光基团， 3'端标记荧光淬灭基团。
[0016] 现有技术中公开的各种荧光基团均可以运用于本发明，举例如下：
[0017] 第1组：荧光基团FAM其荧光波长的峰值在520nm。
[0018] 第2组：荧光基团VIC, JOE, HEX其荧光波长的峰值在550nm。
[0019] 第3组：荧光基团CY3, NED, TAMRA其荧光波长的峰值在580nm。
[0020] 第4组：荧光基团R0X，TEXAS RED其荧光波长的峰值在610nm。
[0021] 第5组：荧光基团CY5其荧光波长的峰值在670nm。
[0022] 优选的突变型探针和野生型探针上的荧光基团分别选自FAM、HEX。
[0023] 现有技术中公开的各种淬灭基团均可以运用于本发明。根据本发明的CYP2C9*2 基因多态性的检测探针，优选的淬灭基团选自MGB、BHQ2。
[0024] 根据本发明的CYP2C9*2基因多态性的检测探针，优选的探针选自如下群组：
[0025] *2 突变型探针 FAM_aacacAgtcctcaAtgctcc_BHQ2
[0026] *2 野生型探针 HEX-ttgaacacGgtcctcaatgctc_BHQ2
[0027] *2 突变型探针 HEX-aacacAgtcctcaAtgctcc_BHQ2
[0028] *2 野生型探针 FAM_ttgaacacGgtcctcaatgctc_BHQ2
[0029] *2 突变型探针 FAM-aacacAgtcctcaAtgctcc-MGB
[0030] *2 野生型探针 HEX-ttgaacacGgtcctcaatgctc-MGB
[0031] *2 突变型探针 HEX-aacacAgtcctcaAtgctcc-MGB
[0032] *2 野生型探针 FAM-ttgaacacGgtcctcaatgctc-MGB
[0033] *2 突变型探针 BHQ2_aacacAgtcctcaAtgctcc_FAM
[0034] *2 野生型探针 BHQ2-ttgaacacGgtcctcaatgctc_HEX
[0035] *2 突变型探针 BHQ2-aacacAgtcctcaAtgctcc_HEX
[0036] *2 野生型探针 BHQ2_ttgaacacGgtcctcaatgctc_FAM
[0037] *2 突变型探针 MGB-aacacAgtcctcaAtgctcc-FAM
[0038] *2 野生型探针 MGB-ttgaacacGgtcctcaatgctc-HEX
[0039] *2 突变型探针 MGB-aacacAgtcctcaAtgctcc-HEX
[0040] *2 野生型探针 MGB-ttgaacacGgtcctcaatgctc-FAM。
[0041] 本发明第二方面提供了一种检