CAGCGGGCTTCCTC
[0115] 反向引物序列 4D1-A-I :GCTGCGGAATTTTGGGATGG。
[0116] 二、配置PCR反应液，
[0117] 每份用量如下：
[0118] 市售的 2 X PCR 反应液（包括 taq 酶，UNG 酶，dNTP, dUTP) 10 μ L
[0119] 引物和探针混合物IyL
[0120] 内参探针混合物1 μ L
[0121] RNase-free 水 7 μ L
[0122]
【主权项】
1. 一种CYP2C9*2基因多态性的检测探针，其特征在于，所示检测探针的核苷酸序列选 自序列1和序列2,并且5'和3'端分别具有荧光基团和淬灭基团，并且荧光基团所发荧光 的波长峰值在不同的位置； 序列 1CYP2C9*2 突变型探针 5' -aacacAgtcctcaAtgctcc-3' 序列 2CYP2C9*2 野生型探针 5' -ttgaacacGgtcctcaatgctc-3'。
2. 根据权利要求1的CYP2C9*2基因多态性的检测探针，其特征在于，所述的淬灭基团 选自 MGB、BHQ2。 所述突变型探针和野生型探针上的荧光基团选自不同的组； 第1组：FAM， 第 2 组：VIC, JOE, HEX 第 3 组：CY3, NED, TAMRA 第 4 组：ROX, TEXAS RED 第5组：CY5。
3. 根据权利要求2的CYP2C9*2基因多态性的检测探针，其特征在于，所述突变型探针 和野生型探针上的荧光基团分别选自FAM、HEX。
4. 根据权利要求2的CYP2C9*2基因多态性的检测探针，其特征在于，所述的淬灭基团 选自 MGB、BHQ2。
5. 根据权利要求1 一 3中任一项的CYP2C9*2基因多态性的检测探针，其特征在于，所 述的探针选自如下群组： *2 突变型探针 FAM_aacacAgtcctcaAtgctcc_BHQ2 *2 野生型探针 HEX-ttgaacacGgtcctcaatgctc_BHQ2 *2 突变型探针 HEX-aacacAgtcctcaAtgctcc_BHQ2 *2 野生型探针 FAM_ttgaacacGgtcctcaatgctc_BHQ2 *2 突变型探针 FAM-aacacAgtcctcaAtgctcc-MGB *2 野生型探针 HEX-ttgaacacGgtcctcaatgctc-MGB *2 突变型探针 HEX-aacacAgtcctcaAtgctcc-MGB *2 野生型探针 FAM-ttgaacacGgtcctcaatgctc-MGB *2 突变型探针 BHQ2_aacacAgtcctcaAtgctcc_FAM *2 野生型探针 BHQ2-ttgaacacGgtcctcaatgctc_HEX *2 突变型探针 BHQ2-aacacAgtcctcaAtgctcc_HEX *2 野生型探针 BHQ2_ttgaacacGgtcctcaatgctc_FAM *2 突变型探针 MGB-aacacAgtcctcaAtgctcc-FAM *2 野生型探针 MGB-ttgaacacGgtcctcaatgctc-HEX *2 突变型探针 MGB-aacacAgtcctcaAtgctcc-HEX *2 野生型探针 MGB-ttgaacacGgtcctcaatgctc-FAM。
6. -种检测CYP2C9*2基因多态性的试剂，其特征在于，所述的试剂包含权利要求1 一 5中任一项的检测探针。
7. -种检测CYP2C9*2基因多态性的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含权利要求 1一 5中任一项的检测探针。
8. -种基因扩增用引物对，所述的引物对包括正向引物和反向引物；正向引物是由序 列3的碱基序列组成的寡核苷酸； 反向向引物由序列4的碱基序列组成的寡核苷酸。 序列 3D1-S-1 :AAGGCAGCGGGCTTCCTC 序列 4D1-A-1 :GCTGCGGAAITTTGGGATGG。
9. 根据权利要求8的基因扩增用引物对，其特征在于，所述的基因扩增用引物对是扩 增生物样品中CYP2C9*2基因的引物对。
10. -种基因扩增用试剂，其特征在于，所述的基因扩增用试剂含有权利要求8 - 9中 任一项所述的基因扩增用引物对。
11. 一种基因扩增用试剂盒，其特征在于，包含能使模板进行扩增的引物，所述的引物 对选自权利要求8 - 9中任一项所述的基因扩增用引物对。
12. -种制备扩增产物的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤： (I) 以样品中的核酸为模板，使用权利要求8 - 9中任一项所述的基因扩增用引物对， 在反应液中进行CYP2C9*2基因的扩增步骤。
13. 根据权利要求12中所述的扩增产物的方法，其特征在于，在所述的步骤（I)中，向 所述反应液中进一步添加与CYP2C9*2基因的检测对象位点杂交的探针。
14. 根据权利要求12中所述的扩增产物的方法，其特征在于，所述的探针是选自权利 要求1 一 5中任一项的探针。
15. 根据权利要求14中所述的扩增产物的方法，其特征在于，该方法还进一步包含下 述步骤（II) (II) 测定所述反应液的所述荧光标记探针中的荧光标记的荧光强度的步骤。
16. -种试剂，其特征在于，所述的试剂含有选自权利要求1 一 5中任一项的探针以及 权利要求8 - 9中任一项所述的基因扩增用引物对。
17. -种试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有选自权利要求1 一 5中任一项的探针 以及权利要求8 - 9中任一项所述的基因扩增用引物对。
18. 根据权利要求17的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有 Tris-HCl(pH 7. 5-9. 0)10-100mmol/L KCL 6-500mmol/L MgCl2L 5-5. Ommol/L dNTP 0. 2mmol/L 选自权利要求8 - 9中任一项的引物200-900nmol/L 选自权利要求1 一 5中任一项的探针100-900nmol/L 耐热DNA聚合酶（Taq酶）2. 0-2. 5U。
19. 根据权利要求18的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有 Tris-HCl(pH 7. 5-9. 0)10-100mmol/L KCL 6-500mmol/L MgCl2L 5-5. Ommol/L dNTP 0. 2mmol/L 选自权利要求8 - 9中任一项的引物200-900nmol/L 选自权利要求1 一 5中任一项的探针100-900nmol/L 耐热DNA聚合酶（Taq酶）2. 0-2. 5U 基因型外对照 内对照。
20. 根据权利要求19的试剂盒，其特征在于，所述的基因型外对照选自突变型基因型 对照、野生型基因型对照和杂合型基因型对照。
21. -种检测CYP2C9*2基因多态性的方法，其特征在于，使用权利要求17-20中任一项 的试剂盒来检测CYP2C9*2基因多态性。
22. 根据权利要求21所述的CYP2C9*2基因多态性的检测方法，其特征在于，该方法包 括如下步骤： (1) 将生物样品进行DNA提取； (2) 将提取的DNA加入权利要求17-20中任一项的试剂盒中的试剂进行PCR扩增； (3) 通过荧光信号的强度来确定CYP2C9*2基因多态性。
23. 根据权利要求22所述的CYP2C9*2基因多态性的检测方法，其特征在于，所述的生 物样品是全血。
24. -种判断华法林的使用量的方法，其特征在于，该方法包括： (1) 通过权利要求21-23中任一项所述的多态性检测方法来检测CYP2C9*2基因多态性 的步骤； (2) 通过所检测出的基因多态性来判断华法林的适用量的步骤。
【专利摘要】本发明公开了一种CYP2C9*2基因多态性的检测探针，所述检测探针的核苷酸序列选自序列1和序列2，5’和3’端分别具有荧光基团和淬灭基团，并且荧光基团所发荧光的波长峰值在不同的位置。优选的淬灭基团选自MGB、BHQ2；优选的荧光基团选自FAM，VIC,JOE,HEX、CY3,NED,TAMRA、ROX,TEXAS？RED、CY5等等。本发明还公开了一种基因扩增用引物对，所述的引物对包括正向引物和反向引物；正向引物是由序列3的碱基序列组成的寡核苷酸；反向引物由序列4的碱基序列组成的寡核苷酸。本发明还公开了含有上述引物和探针的试剂盒以及CYP2C9*2基因多态性的检测方法。
【IPC分类】C12Q1-68, C12N15-11
【公开号】CN104561300
【申请号】CN201410851861
【发明人】李一石, 刘红, 韩璐璐, 田蕾, 娄莹, 王巍, 许建屏
【申请人】中国医学科学院阜外心血管病医院
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年12月31日