人肿瘤预测性生物标志组合物及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于肿瘤基因检测技术领域，具体涉及人肿瘤预测性生物标志组合物及其应用。
【背景技术】
[0002]人类癌症通过基因组畸变的积累而发展，如基因突变，使细胞的病理生理改变发生，如无限生长和转移。越来越多的证据显示人类癌症是一复杂和多样性疾病，患者可能表现出类似的症状，并具有相同的病理改变，但可能由完全不同的基因变化而造成。正因为这样的异质性，某一特定药物或疗法往往只对一部分肿瘤病人有效。因此，不同类型癌症晚期患者对目前可用药物的反应率差别很大，从10%至90%不等。许多较新的生物治疗方法，特别是所谓的革G向治疗(targeted therapy)，也仅仅在小部分具有特异基因突变的患者身上显示有疗效。因此，能前瞻性的确定患者有否可能对某特定治疗起反应的方法具有巨大的临床应用价值，可最大幅度的提高肿瘤的治愈率。
[0003]预测性生物标志物，如基因突变(gene mutat1n)和基因表达(gene express1n)等，可以提供癌症患者是否可能从某特定治疗(如靶向药物)中获益的前期信息，从而用来指导治疗方法的选择。如病人的标志物状态表示对某特定治疗可能有效，则此病人为接受该治疗的候选者。相反，如标志物测定暗示对某一特定治疗有耐药性，则应寻找或获取可能更有益的替代疗法。总之，这些标志物的测定可以帮助临床医生做出明智的决定，以避免不必要的医疗费用，可能无效的治疗以及毒性，提高患者的生活质量。这些标志物也可用于疗效评估，帮助确定最佳药物剂量和毒性预测。本发明即为适合这样的需求而产生。
[0004]目前肿瘤基因治疗如靶向治疗极具潜力，有比传统化疗更大的优越性。而随着越来越多靶向药物的问世和应用或进入临床试验，包括新药审批，基于分子基因检测的生物标志物如基因突变在预测靶向治疗疗效中的作用越来越受重视。目前许多西方国家，如美国，正投入大量的人力和物力寻找这样的预测标志物，目前已有少数用于临床指导干预，包括中国医院。本发明者之一(毛建华博士)在《科学》等杂志发表的新基因路线图开发了一个预测新靶向治疗的方向，如针对FBXW7基因突变的成果已初步取得美国临床运用成功。
【发明内容】
[0005]解决的技术问题:本发明提供一种人肿瘤预测性生物标志组合物及其应用，可用于制备肿瘤预测或筛查试剂盒。
[0006]技术方案:人肿瘤预测性生物标志组合物，包括BRAF、BRCAl、BRCA2、EGFR、FBXW7、H-RAS, IDHl、K-RAS、N-RAS、PIK3CA、PTEN 和 TP53 基因中的至少两个。
[0007]优选的方案，组合物中含有2、4、6或12个所述基因。
[0008]上述人肿瘤预测性生物标志组合物在制备肿瘤预测或筛查试剂盒中的应用。
[0009]上述试剂盒中还包括组合物所含基因的对应引物。
[0010]一种人肿瘤诊断试剂盒，含有检测 BRAF、BRCA1、BRCA2、EGFR、FBXW7、H-RAS、IDHl、K-RAS、N-RAS、PIK3CA、PTEN和TP53中至少两个基因的引物。
[0011]优选的方案，含有2、4、6或12个所述基因的引物。
[0012]检测BRAF的引物序列如SEQ ID N0.1?2所示；检测BRCAl的引物序列如SEQ IDN0.4?11所示；检测BRCA2的引物序列如SEQ ID N0.13?18所示；检测EGFR的引物序列如SEQ ID N0.20?27所示；检测FBXW7的引物序列如SEQ ID N0.29?32所示；检测H-RAS的引物序列如SEQ ID N0.34?37所示；检测IDHl的引物序列为如SEQ ID N0.39?40所示；检测K-RAS的引物序列如SEQ ID N0.42?45所示；检测N-RAS的引物序列如SEQID N0.47?50所示；检测PIK3CA的引物序列如SEQ ID N0.52?55所示；检测PTEN的引物序列如SEQ ID N0.57?62所示；检测TP53的引物序列如SEQ ID N0.64?71所示。
[0013]所述试剂盒中还含有其它必要试剂:dNTPs、MgCl2、反应缓冲液和Taq DNA聚合酶。
[0014]有益效果:本发明通过对十二个基因突变图谱的检测达到对一系列靶向药物治疗进行系统性优化选择。根据此十二个基因在每个肿瘤中的累积突变率(图3)，其在八大恶性肿瘤的应用可覆盖80%左右的癌症病例。通过该试剂盒可以对治病样本中以上各基因进行扩增与纯化测序，并与相应的突变图谱进行检查对比，进而对样本中的肿瘤进行诊断、预测、检测或筛查，系统分析肿瘤通路中各成员的功能状态，包括通路之间和非通路之间的关系；增加基因的数目可增加预测的精确度；确定病人是否需要接受通路中下游基因的靶向治疗，或协同靶向治疗。
【附图说明】
[0015]图1为EGFR/RAS分子信息通路图；
[0016]图2为不同组合的检测基因突变图谱及其在中国八大常见肿瘤中的应用图，其中百分比表示十二个基因在每个肿瘤中的突变率；
[0017]图3为本发明十二个基因在每个肿瘤中的累积突变率图。
【具体实施方式】
[0018]下面的实施例可使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
[0019]本发明不需要从肿瘤病人再次取样，而可以直接用现有病理检查的石蜡样本、月中瘤活检或血液标本。
[0020]从石蜡切片中提取高质量肿瘤样本DNA:先将待测样本去蜡，后将样本用蛋白酶K (Protinase K)消化，最后将DNA提取用于检测基因突变。肿瘤活检或血液标本DNA的提取类似于石蜡切片标本，除了不需去蜡步骤。对于血液标本，首先将肿瘤细胞从血液中分离出来。
[0021]本发明设计和优化了检测位于12个基因序列中突变热点的特定PCR引物。先应用PCR对相应的短基因片段进行扩充，然后对PCR产物进行纯化，最后应用DNA测序仪器来检测相应的基因是否有突变。本发明也开发了用第二代测序仪的方法来检测12个基因的突变，先用本发明设计的针对12个基因的DNAbaits将基因从总DNA中提取出来，然后建库测序。本发明还在在开发应用其它快速、精确和价廉的方法来检测12基因的突变图谱。
[0022]实施例1
[0023]通过检查单个基因IDHl的突变图谱决定肺癌、前列腺癌或其它癌症病人是否应接受IDHl革巴向治疗(AG1-5198等)。
[0024]试剂盒组成:标准96孔PCR板，12个基因的引物(也可选择2、4、或6个基因的引物)，dNTPs、MgCl2、反应缓冲液和Taq DNA聚合酶。
[0025]用上述方法将DNA从病人肿瘤样本中提取出来。将病人肿瘤DNA (20?10ng)按照1:1容积比例加入到本发明设计好的96孔板试剂盒，然后将96孔板放入PCR仪对IDHl进行扩增，用Qiagen或其它PCR纯化试剂将PCR产物纯化，最后用DNA测序仪对IDHl基因进行突变检测。若病人肿瘤组织中含有IDHl突变，则IDHl的靶向治疗对此病人有效。
[0026]实施例2
[0027]通过检测E