方式】
[0027] 下面将通过【具体实施方式】对本发明进行详细说明。
[0028] 实施例1
[0029] 本实施例为利用Fludigm基因分型方法检测杜洛克不同个体基因型以及与眼肌 面积性状关联分析。
[0030] 1、试验材料
[0031] 200个大崑原种场杜洛克F2代资源群体。
[0032] 2、实验试剂
[0033] 基因组提取试剂盒购自Promega，PCR预扩增酶试剂盒购自Qiagen，基因分型芯 片和基因分型试剂盒购自Fludigm，基因分型PCR酶试剂盒购自Biotium，染料ROX购自 Invitrogen0
[0034] 3、基因组DNA的提取
[0035] 杜洛克猪耳组织经组织提取液和蛋白酶K过夜消化后，用Promega公司的DNA Purification Kit 提取，ddH20 溶解，终浓度调节至 80-120 ng/ μ 1，-20°C保存。
[0036] 4、PCR 预扩增
[0037] 预扩增反应体系为：
[0038] Qiagen 2X Multiplex PCR Master Mix : 2.5 μ? IOX STA primer pool : 0.5 μΙ ddH20 : 0.75 μΙ DNA : 1.25 μΙ
[0039] 预扩增反应条件为：95°C预变性15min ;95°C变性15s，60°C退火4min，14个循环； 72°C 延伸 5-8min。
[0040] 5、GT48. 48芯片的初始化
[0041] 将300 μ 1控制液注入GT48. 48,去除芯片底部的蓝色保护膜，将芯片转入MX收集 器，运行Prime(124x)程序。
[0042] 6、引物配制：
[0043] 1)配制 Assay mix :
[0044] ASP1/2(100 μΜ) : 3 μ I
[0045] LSPdOO μ Μ) ： 8 μ 1
[0046] ddH20: 29 μ 1
[0047] 2)配制 10 X Assay
[0048] 2 X Assay Loading Reagent: 2. 5 μ I
[0049] ddH20: I. 5 μ I
[0050] Assay mix: I μ I
[0051] 7、样品混合物配制：
[0052] Biotium 2X Fast Probe Master Mix : 3 μ? SNPtype 20X Sample Loading Reagent: 0.3 μ?
[0053] SNPtype Reagent: 0.1 μ? ROX : 0.036 μΙ ddH20 : 0.064 μ? DNA : 2 5 μ?
[0054] 8、芯片进样
[0055] 取4 μ I IOX Assay和5 μ 1样品混合物分别加入芯片的引物上样孔和样品上样 孔，加好样的芯片放回MX控制器中，运行Mix (124Χ)程序完成进样。
[0056] 9、数据收集
[0057] 完成进样的芯片置入BioMark HD机器，利用基因分型PCR程序进行扩增并搜集荧 光信号，实验完成后利用SNP Genotyping Analysis软件得到样品的基因型信息。
[0058] 10、数据分析
[0059] 利用Fludigm基因分型得到各个体的基因型，结合温氏大崑原种场F2代杜洛克资 源群体的表型记录，将性别作为固定效应，由于表型记录均已通过年龄校正，因此，不考虑 年龄作为固定效应，根据广义线性模型Y= U+Χβ + ε，利用SAS System for Windows 9.0 进行基因型与眼肌面积性状的关联分析：
[0060] 结果显示TT型纯合子的猪眼肌面积性状显著高于杂合子和CC型纯合子的猪（P =0. 0597)，各基因型的最小二乘均值如表1所示。
[0061] 表 1
[0062]
【主权项】
1. 一种与猪眼肌面积性状有关的猪UNC13B基因SNP标志物，其特征在于，该标志物为 UNC13B(Sscrofa10. 2)基因chrl: 263861722 位点T-C的突变。
2. -种用于检测权利要求1所述的SNP标志物的特异性引物，其特征在于，所述引物 为： STA： 5r -CACACTCATTGTATCAATCATAGAGGAA-3r LSP: 5, -AACCACCAAAGAGAGAGAGCCA-3, ASP1 :5' -AGAATTCCTACACGCTTGTTCTGAAT-3' ASP2 ： 5r -GAATTCCTACACGCTTGTTCTGAAC-3r 其中，STA为预扩增上游引物，LSP为预扩增下游引物，ASP1为分型引物1，ASP2为分型 引物2 ; STA和LSP用于通过预扩增PCR扩增UNC13B(Sscrofa10. 2)基因chrl:263861722位点 上下游的序列获得99bp预扩增产物，ASP1和ASP2用于鉴定待测猪个体的UNC13B(Sscrofa 10. 2)基因chrl:263861722位点的基因型。
3. -种检测权利要求1所述的SNP标志物的方法，其特征在于，包括利用权利要求2中 所述的引物进行以下步骤： 预扩增PCR:以待测猪基因组DNA为模板，STA和LSP为引物通过PCR反应获得UNC13B(Sscrofa10. 2)基因chrl:263861722位点上下游共99bp的预扩增产物； 鉴定PCR:以预扩增产物为模板、ASP1和ASP2为引物，获得鉴定PCR扩增产物，判定所 述SNP标志物的基因型。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，预扩增PCR的反应体系为：
预扩增PCR的反应程序为： 95°C预变性 15min;95°C变性 15s，60°C退火 4min，14 个循环；72°C延伸 5-8min。
5. 根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，鉴定PCR的反应以预扩增产物为模 板、ASP1和ASP2为引物，按照所使用的基因分型芯片所给出的程序进行SNP位点基因型鉴 定。
6. -种检测猪眼肌面积性状的试剂盒，其特征在于，含有权利要求2所述的特异性引 物。
7. 权利要求1所述的SNP标志物或权利要求2所述的引物在猪育种中的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种与猪眼肌面积性状有关的猪UNC13B基因SNP标志物，该标志物为UNC13B(Sscrofa？10.2)基因chr1:263861722位点T-C的突变。本发明还提供了用于检测所述SNP标志物的特异性引物。利用本发明所提供的方法可以通过对猪UNC13B基因单碱基多态的判断获得猪眼肌面积性状，从而为猪的育种工作提供指导，选育具有最大猪眼肌面积的TT型猪进行育种和培养。
【IPC分类】C12N15-11, C12Q1-68
【公开号】CN104561306
【申请号】CN201410856669
【发明人】胡晓湘, 方素云, 王润铭, 杨瑞飞, 张苏红, 李宁
【申请人】中国农业大学
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年12月31日