镰刀菌单端孢霉烯族b类毒素pcr检测引物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于食品安全检测领域，特别是镰刀菌单端孢霉烯族B类毒素 PCR检测引 物及其应用。
【背景技术】
[0002] 由镰刀菌引起的赤霉病（Fusarium head blight or scab)是世界范围内一种重 要的流行性病害，它能够危害包括大麦、小麦、玉米、水稻等多种禾谷类作物。随着全球性气 候变暖和区域性气候的反常以及耕作制度的变化，病害的发生频率增加，发生区域不断扩 大。赤霉病不仅导致谷物的产量严重损失，而且镰刀菌可以产生多种真菌毒素，降低粮食和 饲料的品质，严重威胁人和动物的健康，给食品安全带来重大隐患。
[0003] 单端孢霉烯族毒素是镰刀菌产生的最重要的真菌毒素，主要分为A、B两类。它 能够抑制真核细胞蛋白质的合成，破坏人畜的棉衣系统，使中毒者出现呕吐、腹泻、头晕等 多种症状，同时还有一定的致畸和致癌性，根据化学结构的不同，B类单端孢霉烯族毒素 可以分为3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌稀醇（3-acetyldeoxynivalenol，简称3AD0N)、15_乙 酰基脱氧雪腐镰刀菌稀醇（15-acetyldeoxynivalenol，简称15AD0N)和雪腐镰刀菌稀醇 (nivalenol，简称NIV)，在我国主要麦区，禾谷镜刀菌是（Fusarium graminearum Schwabe) 引起赤霉病最主要的病原物，同时也是合成B类单端孢霉烯族毒素的主要病原菌，严重影 响人和动物的安全。
[0004] 目前，真菌毒素含量的检测方法通常有生物学检测法，理化检测方法，免疫化学检 测法等，生物测定法由于缺乏统一的规范化标准及检测分析不准确等原因，在实际镰刀菌 毒素检测中未能得到广泛应用；化学测定法是目前用于镰刀菌毒素含量测定的主要方法， 其特点是准确、重复性好，但是该方法要求的样品提纯较繁琐，技术含量要求较高，不能满 足快速检测的要求；免疫测定法，操作简单，费用较低，但因为检测出的毒素中常含有一些 其它衍生物，所以测定的结果往往不准确，容易出现假阳性；这三种检测方法均不适于快 速、灵敏准确的检测B类单端孢霉烯族毒素污染。
[0005] 近年来，随着多种镰刀菌基因组的公布，分子生物学研宄的迅速发展，国内外的研 宄人员在单端孢霉烯族毒素的合成、毒素合成基因表达调控方面已经取得了重要成果，证 实了一些基因在毒素代谢途径中的重要作用，基于这些研宄结果和相关基因的序列信息， 建立一种简单快速、价格低廉的毒素检测方法成为不同国家研宄人员探索的热点，Kim等 利用Tri5、Tri7和Tril3的基因序列，检测了来自多个寄主中的禾谷镰刀菌DON和NIV 毒素的产生情况（Kim et al. Polymorphism of trichothecene biosynthesis genes in deoxynivalenol-and nivalenoI-producing Fusarium graminearum isolates. Mycol Res. 2003, 107:190-197)，但Tri5的鉴定方法操作繁琐，且费用较高，在实际中很 难得到广泛应用；Chandler等利用Tri7和Tril3的基因序列，设计10对引物检测了三 种镰刀菌产生毒素的情况，但出现了多对引物之间检测结果不一致的现象（Chandler et al.Development of PCR assays to Tri7 and Tri13 trichothecene biosynthetic genes, and characterisation of chemotypes of Fusarium graminearum，Fusarium culmorum and Fusarium cerealis. Physiol. Mol. Plant Pathol. 2003, 62:355-367) ;Li 等 (2005)通过分析禾谷镰刀菌Tri5?Tri6基因间隙区序列，设计了区分DON和NIV化学型 的引物，通过对中国364个菌株的检测，证明该对引物的稳定性很好，适用于禾谷镰刀菌化 学型的大规模检测，但是该项技术不能区分DON毒素的两种衍生物（Li et al. Development of a generic PCR detection of deoxynivalenol-and nivalenoI-chemotypes of Fusarium graminearum. FEMS Microbiol. Lett. 2005, 243:505-511) ;Wang 等对 Tri 13 基因 序列进行比对，设计了特异性引物，可以同时区分合成NIV、3AD0N和15AD0N的菌株（Wang et al. Development of a Generic PCR Detection of 3-Acetyldeoxynivalenol-, 15-Ace tyldeoxynivalenol-and Nivalenol-Chemotypes of Fusarium graminearum Clade. Int. J. Mol. Sci. 2008, 9:2495-2504)，但是最新的研究表明该对引物同样出现了检测结果不吻 合的问题（Wang et al. A multiplex PCR assay for genetic chemotyping of toxigenic Fusarium graminearum and wheat grains for 3-acetyldeoxynivalenoI, 15-acetyldeox ynivalenol and nivalenol mycotoxin. J. Food Agric. Environ. 2012, 10:505-511);由于 以上的一些缺陷，制约了这些方法在粮食和食品安全中毒素的实际应用。
【发明内容】
[0006] 针对上述问题，提供一组镰刀菌单端孢霉烯族B类毒素 PCR检测引物，该组引物能 够通过一次PCR反应，同时检测三种单端孢霉烯族族B类毒素的类型，本发明是这样实现 的：
[0007] 一组镰刀菌单端孢霉烯族B类毒素 PCR检测引物，包括如SEQ ID N0.1所示的共 用上游引物F，如SEQ ID NO. 2所示的3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇下游引物Rl JaSEQ ID NO. 3所示的15-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇下游引物R2,如SEQ ID NO. 4所示的雪腐 镰刀菌烯醇下游引物R3。
[0008] 本发明中所述镰刀菌单端孢霉烯族B类毒素 PCR检测引物在PCR检测3-乙酰基 脱氧雪腐镰刀菌烯醇、15-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇以及雪腐镰刀菌烯醇中的应用。
[0009] 本发明所述的应用中，所述PCR检测是指：以被检测材料DNA为模板，进行PCR反 应，对PCR反应产物进行凝胶电泳，电泳产物中若出现376bp特异性条带，则检测材料中含 有3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇；若电泳产物中出现443bp特异性条带，则检测材料中含 有15-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇；若电泳产物中出现246bp特异性条带，则检测材料中含 有雪腐镰刀菌烯醇。
[0010] 本发明所述应用中，PCR反应的反应体系为：50ng模板DNA，2. 5yL 10XPCR Buffer缓冲液，I. 25mM的dNTPs 1 μ L，Taq DNA聚合酶0.3 μ L，10 μ M的共用上游引物F 0.6 μ L，10 μΜ的3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇下游引物RUlOyM的15-乙酰基脱氧雪 腐镰刀菌烯醇下游引物R2、10 μ M的雪腐镰刀菌烯醇下游引物R3各0. 2 μ L，CldH2O补足至 20 μ L ;PCR 反应条件：94°C 5min ;94°C 30s，58°C 30s，72°C 30s，30 个循环；72°C 10min。
[0011] 本发明利用NCBI中已经公布的禾谷镰刀菌毒素合成基因 Tri5序列设计特异性引 物，进行PCR检测，根据反应产物中是否含有376bp、443bp、246bp的特异性条带，来判断检 测材料中对否含有3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇（3AD0N)、15-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯 醇（15AD0N)和雪腐镰刀菌烯醇（NIV)，本发明通过一次PCR电泳反应，即可直接检测镰刀菌 单端孢霉烯族B类毒素的类型，成本低，操作简单，耗时短（约I. 5h)，检测结果准确，易于大 规模推广应用。
【附图说明】
[0012] 图1为镰刀菌菌株的PCR-电泳检测结果；
[0013] 图2为小麦和玉米籽粒的PCR-电泳检测结果。
【具体实施方式】
[0014] 实施例中涉及的引物序列：
[0015] 共用上游引物 F :TGCATGGCGGATCTATCTATTCACT ;
[0016] 3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇下游引物Rl :ATGACCCAAGCCATTCATGCGT ;
[0017] 15-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇下游引物R2 :
[0018] GACGTGATTTCAAGGAAATGCTTC ；
[0019] 雪腐镰刀菌烯醇下游引物R3 :CAGGTAAATAATACAATCGG ;
[0020] 实施例所设计的培养基/试剂：
[0021] PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉15g，蒸馏水定容至IOOOml ;实 施例涉及的提取液中含有：100mm〇l · PTris-HCKpH 8.0)，20mmol · LlDTAbH 8.0)， I. 5mol · T1NaCl,以及占提取液质量2%的CTAB。
[0022] 实施例1镰刀菌菌株检测
[0023] 本实例所用的镰刀菌菌株在中国不同该地区采集，其产毒素类型经LC/MS确定 (表 1)。
[0024]
【主权项】
1. 一组镰刀菌单端孢霉烯族B类毒素 PCR检测引物，包括如SEQ ID NO. 1所示的共用 上游引物F，如SEQ ID NO. 2所示的3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇下游引物Rl，如SEQ ID NO. 3所示的15-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇下游引物R2,如SEQ ID NO. 4所示的雪腐镰刀 菌烯醇下游引物R3。
2. 如权利要求1所述镰刀菌单端孢霉烯族B类毒素PCR检测引物在PCR检测3-乙酰 基脱氧雪腐镰刀菌烯醇、15-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇以及雪腐镰刀菌烯醇中的应用。
3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述PCR检测是指：以被检测材料DNA为 模板，进行PCR反应，对PCR反应产物进行凝胶电泳，电泳产物中若出现376bp特异性条带， 则检测材料中含有3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇；若电泳产物中出现443bp特异性条带， 则检测材料中含有15-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇；若电泳产物中出现246bp特异性条带， 则检测材料中含有雪腐镰刀菌烯醇。
4. 根据权要求3所述的应用，其特征在于，所述PCR反应的反应体系为：50ng模板DNA， 2.5yL IOXPCR Buffer 缓冲液，1.25mM 的 dNTPs IyL，Taq DNA 聚合酶 0.3yL，10μΜ 的共用上游引物F 0. 6 μ L，10 μΜ的3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇下游引物Rl、10 μΜ的 15-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇下游引物R2、10 μM的雪腐镰刀菌烯醇下游引物R3各 0· 2 μ L，CldH2O 补足至 20 μ L ; PCR 反应条件：94°C 5min; 94°C 30s，58°C 30s，72°C 30s，30 个循环；72°C lOmin。
【专利摘要】本发明公开一组镰刀菌单端孢霉烯族B类毒素PCR检测引物，包括如SEQ？ID？NO.1所示的共用上游引物F，如SEQ？ID？NO.2所示的3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇下游引物R1，如SEQ？ID？NO.3所示的15-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇下游引物R2，如SEQ？ID？NO.4所示的雪腐镰刀菌烯醇下游引物R3，该组引物可应用于PCR直接检测3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇、15-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇以及雪腐镰刀菌烯醇，成本低，操作简单，耗时短，检测结果准确，易于大规模推广应用。
【IPC分类】C12N15-11, C12Q1-68
【公开号】CN104561307
【申请号】CN201510001950
【发明人】仇剑波, 董飞, 徐剑宏, 史建荣
【申请人】江苏省农业科学院
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2015年1月5日