一种针对循环肿瘤细胞的lncRNA和AR3联合检测试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学技术领域，具体地说，是一种针对循环肿瘤细胞的IncRNA 和AR3联合检测试剂盒及用于诊断AR相关肿瘤的去势抵抗及复发。
【背景技术】
[0002] 癌症占人类死亡病因的近1/4。在过去的几十年里肿瘤复发和转移仍是改善整体 存活率的主要障碍，这可能主要归因于人们对于癌症生物学仍然缺乏全面的了解。例如，功 能基因组学研宄的最新进展表明，参与人类基因转录的绝大多数是非编码RNA。然而，对于 IncRNAs在调控癌症基因表达及机制等方面人类仍然所知甚少[1]。
[0003] 近期我们通过对肿瘤表观遗传机制的研宄发现IncRNAs可以通过多种机制调控 肿瘤的进展。新近有研宄表明IncRNA PCGEMl可以与雄激素受体AR结合作用[2]。PCGEMl 在前列腺癌上调[3]，可促进细胞增殖[4]，而我们则通过临床标本研宄发现，PCGEMl的 基因表达与前列腺癌恶性程度及转移复发呈高度相关性，PCGEMl不但可以通过与AR直接 作用，更重要的是PCGEMl与AR异构体（如AR3)的表达呈高度正相关，我们进一步证明了 PCGEMl通过选择性转录修饰调控了 AR的异构体如AR3的表达。由此发现IncRNAs如PCGffll 可能通过调控AR基因转录的表观遗传机制参与AR相关肿瘤的增殖、恶性侵袭复发及转移 驱动。因为在一定程度上是由于AR的异构体如AR-V7(AR3)介导了该类肿瘤的激素去势抵 抗，而并非野生型全长AR。而研宄已表明AR-V7在很大程度上诱导形成了相关肿瘤如前列 腺癌的激素去势抵抗[5]。
[0004] 针对上述AR相关肿瘤的特异性调节IncRNAs如PCGEMl和该类肿瘤的激素去势抵 抗的高度相关AR异构体（如AR3)的表达呈高度相关性，通过荧光原位杂交及免疫组织化 学技术联合检测临床组织标本的上述指标，可以高度有效的评估和预测诊断AR相关肿瘤 的激素去势抵抗和复发转移，并在激素去势抵抗和复发转移的早期做出诊断。该项申请的 技术及试剂盒是基于当前最新的研宄结果而建立。这是一种目前其他方法都无法替代的检 测方法，迄今为止尚未见相关报道。
[0005] -方面，循环肿瘤细胞（circulating tumor cells, CTCs)，即从实体肿瘤中脱落 并进入血液循环，形成随血液循环的肿瘤细胞。这些细胞被认为和肿瘤的远端转移等问题 有重大关系，目前较成熟的检测技术多采用免疫标记方法进行分离检测分析，目前已经有 成熟的技术手段用于循环肿瘤细胞的分离和鉴定，如美国强生公司旗下Veridex公司研发 的CellSearch系统，该系统具有很好的特异性、灵敏度、准确性和可重复性，是目前唯一获 得FDA、SFDA认证的技术，在美国已经被广泛应用到临床诊断。
[0006] 另一方面，直观快捷地检测基因；此外，能够高效、准确的检测该特异性目标检测 基因，并放大该信号，较常规的染色检测更为灵敏和精确。本发明是基于最新的长链非编码 RNA(IncRNA)参与的肿瘤表观遗传调控机制。最重要的是联合检测PCGHMl及雄激素受体异 构体AR-V7 (AR3)，是建立在IncRNAs PCGEMl通过本发明证明的表观遗传调控机制的基础 上。即IncRNA PCGEMl通过调控AR-VT(ARS)Pre-HiRNA的转录后修饰及共定位，直接决定了 表达雄激素受体的肿瘤如前列腺癌、肺癌及乳腺癌等的激素去势治疗后去势抵抗或复发转 移。尤其本发明基于研究所发现的IncRNA PCGEMl通过调控pre-niRNA剪切的转录后修饰控 制雄激素受体（AR)异构体（AR-V7(AR3))的产生的新理论。该IncRNA PCGEM1-AR-V7(AR3) 调节机制的新理论所介导的雄激素受体（AR)的激素去势治疗后去势抵抗或复发转移。联 合检测循环肿瘤细胞的PCGEMl及雄激素受体异构体AR-V7 (AR3)的表达可以有效的预测和 评价雄激素受体（AR)的激素去势治疗后去势抵抗或复发转移情况。
[0007] 参考文献：1. Xie Cj Yuan Jj Li Hj Li Mj Zhao Gj Bu D，et al. N0NC0DEv4:exploring the world of long non-coding RNA genes. Nucleic acids research. 2013 ；doi:10.1093/nar/gktl222.
[0008] 2. Yang L，Lin C，Jin C，Yang JC，Tanasa B，Li W，et al. lncRNA-dependent mechanisms of androgen-receptor-regulated gene activation programs. Nature. 2013 ；29:598-602.
[0009] 3. Srikantan V，Zou Z，Petrovics G，Xu L，Augustus M，Davis L，et al. PCGEM1，a prostate-specific gene, is overexpressed in prostate cancer. Proceedings of the NationalAcademy ofSciences ofthe United States ofAmerica. 2000 ；97:12216-21.
[0010] 4. Petrovics G，Zhang W，Makarem M，Street JP，ConnelIy R，Sun L，et al.Elevated expression of PCGEMlj a prostate-specific gene with cell growth-promoting function, is associated with high-risk prostate cancer patients. Oncogene. 2004 ;23:605_11.
[0011] 5. Antonarakis ES, et al. AR-VTand resistance to enzalutamide and abiraterone in prostate cancer.The New Englandjournal ofmedicine.2014 ； 371，1028-1038.
【发明内容】
[0012] 本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供长链非编码RNA(IncRNA)的用途。
[0013] 本发明的再一的目的是，提供用于检测IncRNA及检测雄激素受体异构体 AR-V7(AR3)的核酸引物。
[0014] 本发明的另一的目的是，提供一种针对循环肿瘤细胞的IncRNA和AR3联合诊断试 剂盒。
[0015] 本发明的第四个目的是，提供上述试剂盒的用途
[0016] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
[0017] 长链非编码RNA在调控pre-mRNA剪切的转录后修饰控制雄激素受体异构体 AR-V7(AR3)的产生中的应用，所述的长链非编码RNA为IncRNA PCGEMl。
[0018] 为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
[0019] 用于检测长链非编码RNA及检测雄激素受体异构体AR-V7(AR3)的核酸引物，所述 IncRNA为循环肿瘤细胞中的特异性IncRNA PCGEMl ;所述检测长链非编码RNA的核酸引物 序列为
[0020] PCGEM1-5. I(SEQ ID NO. I) ：TTTTTGCCCTATGCCGTAAC,
[0021] PCGEM1-3. 1(SEQ ID NO. 2) :GGAGACTCCCAACCTGATGA ;或为
[0022] PCGEM1-5. 2(SEQ ID NO. 3) ：GGTAGGCACGTGGAGGACTA,
[0023] PCGEM1-3. 2(SEQ ID NO. 4) ：TGCTTTTGTGGGTTTGTTCA ；
[0024] 所述检测雄激素受体异构体AR_V7(AR3)的核酸引物序列为
[0025] AR3-5. I(SEQ ID NO. 5) ：GCAATTGCAAGCATCTCAAA,
[0026] AR3-3. I(SEQ ID NO. 6) :GGAGGGAGTCAGCAATCAAG。
[0027] 为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：
[0028] -种针对循环肿瘤细胞的IncRNA和AR3联合诊断试剂盒，所述联合诊断试剂盒通 过实时定量PCR技术联合检测IncRNA及雄激素受体异构体AR-V7(AR3);所述长链非编码 RNA为循环肿瘤细胞中的特异性IncRNA PCGEMl。
[0029] 所述检测IncRNA PCGEMl的核酸引物序列为：
[0030] PCGEM1-5. I(SEQ ID NO. I) ：TTTTTGCCCTATGCCGTAAC,
[0031] PCGEM1-3. 1(SEQ ID NO. 2) :GGAGACTCCCAACCTGATGA ;或为
[0032] PCGEM1-5. 2(SEQ ID NO. 3) ：GGTAGGCACGTGGAGGACTA,
[0033] PCGEM1-3. 2(SEQ ID NO. 4) :TGCTTTTGTGGGTTTGTTCA。
[0034] 所述检测雄激素受体异构体AR-V7(AR3)的两条核酸引物序列为：
[0035] AR3-5. I(SEQ ID NO. 5) ：GCAATTGCAAGCATCTCAAA ；
[0036] AR3-3. I(SEQ ID NO. 6) :GGAGGGAGTC