一种检测奶牛乳房炎抗性的dna甲基化的分子标记的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子标记，具体地说，涉及一种检测DNA甲基化的分子标记。
【背景技术】
[0002] 奶牛乳房炎是影响世界奶业发展的主要疾病之一，也是造成奶牛养殖损失最主要 的疾病。奶牛乳房炎不仅会影响奶牛的产奶量，降低原料奶的品质，还会影响奶牛正常生理 功能，增加母牛流产率及淘汰率。奶牛乳房炎的遗传力较低，仅为〇. 02-0. 04之间，传统的 育种方法对其选择效果不明显。随着分子遗传学、数量遗传学和分子生物学技术的飞速发 展，分子育种技术逐步应用到畜禽育种中去，并取得了一定的成果。奶牛乳房炎受环境影响 较大，研宄者们正致力于通过寻找与奶牛乳房炎抗性相关的表观遗传分子标记及相关靶基 因来选择乳房炎抗性高的个体，为培育具有乳房炎抗性的奶牛新品系奠定基础。
[0003] 表观遗传学是指DNA的序列没有发生改变，而基因的表达却发生了可遗传的变 化。表观遗传学的修饰方式和调节机制主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA等 方面。这些修饰方式和调节机制易受环境的作用，因此与经典遗传学相比，表观遗传学更关 注环境诱导的可遗传变异。DNA甲基化（DNA methylation)是指在DNA甲基转移酶的作用 下，CpG二核苷酸的胞嘧啶（C)被选择性地添加甲基基团。大量研宄表明，DNA甲基化对奶 牛乳房炎的发生、发展和维持具有重要的影响。
[0004] 转运蛋白颗粒复合体 9 基因 （trafficking protein particle complex 9，TRAPPC9)位于奶牛的14号染色体上，全长387232bp，cDNA全长4179bp，拥有22个外显 子。其编码的蛋白转运蛋白颗粒复合体9也叫做NIBP (NIK and IKK β-binding protein)， 具有参与NF-K B信号通路激活的过程、参与膜泡运输、参与内质网到高尔基体的囊泡转移 和参与神经细胞的分化等功能。NF- κ B信号通路是一个非常重要的炎症调控通路，尤其是 在维持表皮和上皮细胞内环境稳态中发挥着重要的作用。大量研宄表明NF-κ B信号通路 在奶牛乳房炎发生、发展过程中发挥着重要调控作用。我们前期研宄发现，TRAPPC9基因是 奶牛乳房炎抗性的重要候选基因，但目前关于奶牛TRAPPC9基因的DNA甲基化对乳房炎抗 性的影响还没有报道。
[0005] 目前，定性研宄DNA甲基化的方法有很多，而定量分析DNA甲基化水平的方法却很 少，而且费用昂贵，通量低。新发展的焦磷酸测序技术，是针对目的基因 DNA甲基化进行定 量分析的新一代测序技术，目前，该测序平台已经升级到第二代，一次能够检测400bp的序 列。该技术通过预先设计的反应体系，在一次检测中快速、准确、定量一个或多个甲基化位 点，是目前最理想的DNA甲基化定量分析技术。目前，焦磷酸测序法在人类疾病检测中有很 多报道，但在传统的动物疾病研宄中鲜有报道。因此利用焦磷酸测序方法进行奶牛乳房炎 抗性候选基因的DNA甲基化定量分析，对研宄奶牛乳房炎抗性具有重要意义。同时，也为后 续的分子育种提供了可靠的表观遗传学分子标记素材和理论基础。
【发明内容】
[0006] 为了解决现有技术中对奶牛乳房炎抗性基因的DNA甲基化研宄的缺陷，本发明的 目的是提供一种检测奶牛乳房炎抗性的TRAPPC9基因甲基化的分子标记及其引物。
[0007] 为了实现本发明的目的，本发明首先提供了一种检测奶牛乳房炎抗性的DNA甲基 化的分子标记，所述分子标记是通过针对牛TRAPPC9基因，选取其启动子区内的一段富含 CpG二核苷酸的序列，将其CG座位替换为YG座位，再将其余C碱基全部替换为T碱基而得 到。
[0008] 具体地，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[0009] 本发明还提供了一种用于扩增前述分子标记的扩增引物对，所述扩增引物对的上 游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示。 [0010] 本发明还提供了一种用于检测奶牛乳房炎抗性的DNA甲基化的测序引物，所述测 序引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 5所示。
[0011] 本发明还提供了一种包含前述测序引物对试剂盒。
[0012] 本发明还提供了一种检测奶牛乳房炎抗性的DNA甲基化的方法，所述方法包括以 下步骤：
[0013] 1)提取待测奶牛基因组DNA ;
[0014] 2)基因组DNA的重亚硫酸盐处理；
[0015] 3)以步骤2)处理后的基因组DNA为模板，利用前述扩增引物对，在其下游引物的 5'端按照5'一 3'方向连接通用引物，并在有生物素标记的通用引物的参与下，进行热启动 PCR扩增，得到PCR扩增产物；
[0016] 其中，所述通用引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 6所示；
[0017] 4)利用前述测序引物对，用焦磷酸仪对步骤3)获得的PCR产物进行测序，定量检 测CpG座位的甲基化程度。
[0018] 进一步地，所述步骤3)中PCR扩增的反应体系为：重亚硫酸盐处理的基因组 DNA 4 μ 1，10 μ M的上游扩增引物1 μ 1，10 μ M的下游扩增引物0. 1 μ 1，10 μ M的通用引物 0. 9μ1，（ΜΗ20 14yl，Zymo Premix 20yl;PCR 扩增的反应条件为：95°C预变性 15min; 94°C变性 30sec，58°C退火 30sec，72°C延伸 30sec，45 个循环；72°C延伸 IOmin ;4°C保存。
[0019] 其中，前述方法中所述的奶牛为荷斯坦牛。
[0020] 本发明还提供了一种优化奶牛育种的方法，具体为利用前述方法检测奶牛乳房炎 抗性的DNA甲基化，筛选出基因启动子区甲基化标记中DNA未甲基化的TRAPPC9基因的奶 牛进行育种。
[0021] 本发明还提供了前述分子标记在优化奶牛育种中的应用。
[0022] 本发明的有益效果在于：
[0023] 本发明通过前述分子标记设计的TRAPPC9基因 DNA甲基化引物序列具有较强特异 性，配合焦磷酸仪，可用于有效、准确、定量检测奶牛TRAPPC9基因 DNA甲基化程度。该特异 引物所检测出的TRAPPC9基因甲基化作为新型的表观遗传分子标记，为培育具乳房炎抗性 的奶牛分子育种提供理论依据和遗传基础。
【附图说明】
[0024] 图1为4头试验中国荷斯坦奶牛的焦磷酸测序结果图；
[0025] 其中：A和B所示个体属于乳房炎易感个体；C和D所示个体属于乳房炎抗性个体。
【具体实施方式】
[0026] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。如未特别指明，实施例 中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0027] 实施例1与中国荷斯坦牛乳房炎抗性相关的DNA甲基化分子标记甲基化水平的检 测
[0028] I. 1待测中国荷斯坦奶牛血液基因组DNA提取
[0029] 尾静脉采集待测中国荷斯坦奶牛血液，常温放置3-4小时待血液凝固，此时血液 分为血清和凝血块两部分，血清呈清亮黄色，凝血块为暗红色，牛血液中只有白细胞内含有 DNA，存在于凝血块中。
[0030] 利用天根血液/细胞/组织基因组DNA样品提取试剂盒从凝血块中提取基因组 DNA，具体步骤如下：
[0031] 用眼科剪剪取0. 2-0. 3mL的凝血块放入已灭菌的2mL圆底离心管中，加入500 μ L 的细胞裂解液CL ;
[0032] 利用手持匀浆仪将血块充分匀浆，振荡15s，12000rpm离心lmin，弃去上层暗红色 上清液；
[0033] 再次加入700 μ L细胞裂解液CL，充分振荡使下层沉淀散开悬浮，12000rpm离心 lmin，弃去上清液；
[0034] 加入200 μ L缓冲液GS，充分涡旋至沉淀充分悬浮；
[0035] 加入20 μ L蛋白酶K和250 μ L缓冲液GB，充分混匀；
[0036] 将离心管用封口膜封好放入到56°C杂交炉中消化3-4小时，为确保充分消化，消 化过程中需要颠倒混匀数次，最终溶液变成清亮透明，简短离心；
[0037] 加入200 μ L冰镇无水乙醇，上下颠倒混匀15s，此时可能会出现絮状沉淀；
[0038] 将上一步所得溶液转入吸附柱CB3中，吸附柱放入收集管中，12000rpm离心30s， 弃去收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中；
[0039] 向吸附柱CB3中加入500 μ L去蛋白缓冲液⑶，静置2min，12000rpm离心30s，弃 去收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中；
[0040] 向吸附柱CB3中加入700 yL漂洗液PW，12000rpm离心30s，弃去收集管中的废液， 将吸附柱放入收集管中；
[0041] 向吸附柱CB3中加入500 yL漂洗液PW，12000rpm离心30s，弃去收集管中的废液；
[0042] 将吸附柱放入收集管中，12000rpm离心2min，弃去废液，将吸附柱置于室温放置 数分钟，彻底挥发吸附柱上残余的乙醇；
[0043] 将吸附柱转入至一个新的离心管中，加入100 μ L 56°C预热的TE缓冲液，室温放 置5min，12000rpm离心2min，基因组DNA则存在于离心管中。
[0044] 利用NanoDrop2000紫外分光光度计检测基因组DNA提取的质量与浓度，-20°C保 存备