用。
[0045] 1. 2基因组DNA重亚硫酸盐处理
[0046] 本研宄利用EZ DNA Methylation-Gold Kit试剂盒对基因组DNA进行处理，为保 证样品转化完全，每份样品处理1 μ g的DNA。具体步骤如下：
[0047] I) CT Conversion Reagent 的制备：通过添加 900 μ 1 水，50 μ 1 的 M-Dissolving Buffer，和 300 μ 1 的 M-Dilution Buffer 到一管的 CT Conversion Reagent 中；
[0048] 2)在 PCR 管中添加 130 μ 1 的 CT Conversion Reagent 到每 20 μ IDNA 样品中，如 果DNA样品的体积小于20 μ 1，则用水来弥补差量。
[0049] 3)将样品放到PCR仪上反应，反应条件为：98°C 10min，64°C 2. 5h ;
[0050] 4)添加 600 μ I 的 M-Binding Buffer 到 Zymo-Spin IC Column 吸附柱中，并将吸 附柱试剂盒所提供的Collection Tube中；
[0051] 5)将步骤3样品转移到含有M-Binding Buffer的吸附柱中，盖上盖颠倒混匀， 13000rpm离心lmin，弃废液；
[0052] 6)添加 100 μ 1 的 M-Wash Buffer 到柱中，13000rpm 离心 30sec ;
[0053] 7)添加 200 μ 1 的 M-Desulphonation Buffer 到柱中并且在室温（20°C -30°C )下 放置15-20分钟，然后13000rpm离心30sec，弃废液；
[0054] 8)添加 200 μ 1 的 M-Wash Buffer 到柱中，13000rpm 离心 30sec，重复一次；
[0055] 9)在柱中央加入10 μ I ddH20, Imin后13000rpm离心lmin，收集洗脱液_20°C保 存。
[0056] 1. 3用于焦磷酸测序的热启动PCR扩增
[0057] PCR40 μ 1扩增体系，分别为：重亚硫酸盐处理的基因组DNA 4 μ 1，10 μ M的上游扩 增引物lul(SEQ ID Ν0·3)，10μΜ的下游扩增引物(λ lyl(SEQ ID Ν0·4)，10μΜ的通用引 物 0· 9 μ 1 (5, -biotin-GGGACACCGCTGATCGTTTA-3'），CldH2O 14 μ 1，Zymo Premix 20 μ I ;PCR 反应条件为：95°C预变性15min ;94°C变性30sec，58°C退火30sec，72°C延伸30sec，45个循 环；72°C延伸IOmin ;4°C保存。获得带有生物素标记的扩增产物，_20°C避光保存。
[0058] I. 4PCR产物焦磷酸测序
[0059] 本研宄利用QIAGEN公司的焦磷酸测序仪进行DNA甲基化水平定量检测，同时利用 该公司提供的Pyro Q-CpG软件进行测序Assay设计及相关参数设定。具体操作步骤如下：
[0060] 1)在测序开始前，提前90min打开仪器预热，连接电脑与测序仪，同时控制室温在 18-25°C 之间；
[0061] 2)利用Pyro Q-CpG软件针对相应的测序片段进行Assay的设计，根据配套的实验 设备设定合适的实验参数；
[0062] 3)将上一步获得的PCR扩增产物与2 μ I Beads，37 μ I Binding buffer混合，在 振荡器上振荡20min，使PCR产物与Beads充分结合；
[0063] 4)取40 μ I Annealing buffer与2 μ 1测序引物（10 μM)混合到酶标板上；
[0064] 5)制备单链：利用 Pyrosequencing Vacuum Prep Tool 充分吸取 Beads-PCR 混合 物，然后将Beads-PCR混合物分别在70%乙醇纯化5sec，在Denature buffer中变性5sec， 在Washing buffer中洗绦15sec，然后将探头竖直举起直至水被抽干；
[0065] 6)将探头对准酶标板，关闭真空，在酶标板上空停留3sec后，将探头放入酶标板， 轻轻晃动探头，将制备的单链溶入到Annealing buffer和测序引物混合物中；
[0066] 7)将酶标板放在80°C的金属浴上加热2min，然后冷却到室温；
[0067] 8)打开Pyro Q-CpG软件，根据具体实验设定运行程序并获得酶和碱基的加样量；
[0068] 9)将酶、底物和各个碱基按照要求加入到试剂槽中，然后将试剂槽和酶标板放入 到测序仪中，然后运行程序；
[0069] 10)测序完成后，利用Pyro Q-CpG软件分析出测序结果，从而获得待测样品DNA甲 基化水平数据。
[0070] 1. 5上述DNA甲基化标记在中国荷斯坦牛乳房炎抗性优势品种选育中的应用
[0071] 该DNA甲基化标记可作为新型表观遗传标记用于分子育种，从而加快中国荷斯坦 牛乳房炎抗性优势品种的选育。
[0072] 实施例2TRAPPC9基因启动子区甲基化状态与乳房炎抗性的关联分析与检测应用
[0073] 按照实施例1的方法，对采自北京地区不同奶牛养殖场的152头中国荷斯坦奶牛 进行甲基化状态检测，检测结果如图1所示，可见每个CpG位点均存在甲基化与未甲基化质 的变异。
[0074] 运用SAS 9. 0软件的GLM过程分析各个CpG位点甲基化与否与中国荷斯坦牛乳房 炎抗性的关联关系，采用的模型如下：
[0075] y = μ +hys+p+m+e
[0076] 其中，y为表型值，μ为表型值群体均值，hys为场年季效应，p为胎次效应，m为 甲基化效应，e为随机残差效应。分析结果如表1所示。
[0077] 表1中国荷斯坦奶牛TRAPPC9基因启动子区甲基化状态与乳房炎抗性关联分析
[0078]
【主权项】
1. 一种检测奶牛乳房炎抗性的DNA甲基化的分子标记，其特征在于，所述分子标记是 通过针对牛TRAPPC9基因，选取其启动子区内的一段富含CpG二核苷酸的序列，将其CG座 位替换为YG座位，再将其余C碱基全部替换为T碱基而得到。
2. 根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID No. 2 所示。
3. -种用于扩增权利要求1或2所述的分子标记的扩增引物对，其特征在于，所述扩 增引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示。
4. 一种用于检测奶牛乳房炎抗性的DNA甲基化的测序引物，其特征在于，所述测序引 物的核苷酸序列如SEQ ID No. 5所示。
5. 包含权利要求4所述的测序引物的试剂盒。
6. -种检测奶牛乳房炎抗性的DNA甲基化的方法，其特征在于，所述方法包括以下步 骤： 1) 提取待测奶牛基因组DNA ; 2) 基因组DNA的重亚硫酸盐处理； 3) 以步骤2)处理后的基因组DNA为模板，利用权利要求3所述的扩增引物对，在其下 游引物的5'端按照5' 一 3'方向连接通用引物，并在有生物素标记的通用引物的参与下， 进行热启动PCR扩增，得到PCR扩增产物； 其中，所述通用引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 6所示； 4) 利用权利要求4所述的测序引物，用焦磷酸仪对步骤3)获得的PCR产物进行测序， 定量检测CpG座位的甲基化程度。
7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中PCR扩增的反应体系为： 重亚硫酸盐处理的基因组DNA 4 μ 1，10 μ M的上游扩增引物1 μ 1，10 μ M的下游扩增引物 0.1以1，1(^]\1的通用引物0.9 4 1，(1(1!120 14 4 1，27111〇?代11^2(^1屮0?扩增的反应条件 为：95°C预变性 15min ;94°C变性 30sec，58°C退火 30sec，72°C延伸 30sec，45 个循环；72°C 延伸IOmin ;4°C保存。
8. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述奶牛为荷斯坦牛。
9. 一种优化奶牛育种的方法，其特征在于，利用权利要求6所述的方法检测奶牛乳房 炎抗性的DNA甲基化，筛选出基因启动子区甲基化标记中DNA未甲基化的TRAPPC9基因的 奶牛进行育种。
10. 权利要求1或2所述的分子标记在优化奶牛育种中的应用。
【专利摘要】本发明提供了一种检测奶牛乳房炎抗性的DNA甲基化的分子标记及其引物对。根据所述分子标记设计的扩增引物对和测序引物对，可对奶牛乳房炎抗性的DNA甲基化进行检测。所述检测的方法为：将待测奶牛的基因组DNA经过重亚硫酸盐处理，利用扩增引物对进行TRAPPC9基因的PCR扩增，再利用测序引物对配合焦磷酸仪进行测序，即可检测待测奶牛的TRAPPC9基因启动子区的甲基化程度。本发明为培育具乳房炎抗性的奶牛分子育种提供理论依据和遗传基础。
【IPC分类】C12Q1-68, C12N15-11
【公开号】CN104561304
【申请号】CN201410855830
【发明人】俞英, 董易春, 王晓
【申请人】中国农业大学
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年12月31日