一种尼罗罗非鱼性染色体DNA文库的构建方法与流程

本发明涉及一种尼罗罗非鱼性染色体DNA文库的构建方法，属于分子生物学技术领域。

背景技术：

染色体是鱼类遗传物质的主要载体，在光学显微镜或电子显微镜下都可以看到染色体的存在，并且自然界中的鱼类的染色体形态特征各异，在细胞分裂过程中，染色体的形态和结构在分裂中期和早后期表现得最为明显和典型，此时染色体收缩到最粗最短的程度，所以通常以这个时期进行染色体形态的识别和研究。

目前鱼类染色体的分离手段分为两种：玻璃针切割法和激光切割法：

玻璃针切割法是在倒置显微镜下，用直径不超过0.5μm 的玻璃纤维对染色体直接进行切割，该方法已在多种动植物染单色体分离上得到应用，但该技术操作困难，不易掌握，在一定程度上限制了其应用。

激光切割法是借助激光对目标染色体灼烧进行显微切割、分离。可以借助于切割系统借助于系统软件直接对目标染色体进行可视化切割。切割操作简单，容易掌握，但同时存在制片技术操作要求高等问题，同时由于设备条件要求相对较高，目前该方法在国内使用较少，因此缺乏较为详实的操作流程和技术规范。

目前鱼类性染色体基因组构建主要是基于高通量测序和生物信息学，而罗非鱼的性染色体上的基因学相关研究还没有具体展开，因此利用新技术分离性染色体然后来开展相关基因组学研究是一种高效、经济的方法，能够为通过生物技术提升罗非鱼苗种雄性率的技术难题提供分子学理论支持。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服上述不足之处，提供一种标准化、效率高、操作简便的尼罗罗非鱼性染色体DNA文库的构建方法。

按照本发明提供的技术方案，一种尼罗罗非鱼性染色体DNA文库的构建方法，步骤如下：

（1）尼罗罗非鱼头肾细胞培养：选用体重50g以上的尼罗罗非鱼断尾排血，取头肾组织用生理盐水清洗2～3次，经细胞筛过滤后将细胞悬液装入离心管，1000rpm离心8～12min，弃清液，加入细胞培养液并转移至培养瓶中，置于28℃、5%CO₂培养箱中，培养72～96h；细胞培养终止前2～3h滴加秋水仙素至终浓度为0.05 mg/L，混匀；

（2）细胞低渗处理：将步骤（1）所得培养瓶中的细胞转移至离心管中，1200rpm离心8～12min，去上清，在离心管中加入质量浓度为0.075% KCl溶液8～10mL形成细胞悬液，于28～37℃温育45min～1h；

（3）细胞固定：经低渗处理后的悬液1200rpm离心8～12min，去上清，沉淀吹打混匀后加入卡诺氏固定液2～3mL，吹打细胞悬液后固定，1200rpm离心8～12min，去上清，室温下重复固定两次；

（4）制片：向步骤（3）固定后的细胞中加入卡诺氏固定液3～4mL，吹打成悬液，将POL膜载玻片放置成45度角，将细胞悬液从1m高处滴片，每片滴加悬液2～3滴，将膜置于烘箱中65～75℃烘干25～35s，干燥后用体积浓度为10%姬姆萨染色液3～4滴扣染15～25min，然后用蒸馏水冲洗膜片，室温中晾干；所述姬姆萨染色液为姬姆萨原液用水稀释后所得；

（5）染色体切割、分离：将步骤（4）晾干后的POL膜载玻片置于激光显微切割仪载物台上，在40倍物镜下找到目标染色体，将物镜调到150倍油镜后进行冷激光显微切割，并保留在PCR管中；

（6）酶切及接头连接：向步骤（5）的PCR管中加入20μL终浓度为5～20mg/L的蛋白酶K消化液，12000rpm离心10～15min、然后放入55℃水浴锅温浴2～3h、75℃变性10～15min，加入2μL终浓度为0.01U/μL的Sau3A I酶酶切缓冲液；在37℃酶切3～4h、70℃变性20min，加入2μL终浓度为 5mg/L的接头，16℃过夜连接，70℃变性20 min；

（7）扩增及回收：LA-PCR扩增分为两轮，第一轮取步骤（6）获得的连接产物作为模板，第二轮以第一轮扩增产物作为模板，回收第二轮PCR的扩增产物；

（8）步骤（7）回收的产物测序及片段分析。

步骤（1）依次采用细胞筛目数为100目、150目的筛网对尼罗罗非鱼头肾细胞过滤。

步骤（1）所述细胞培养液为RMPI1640细胞培养液，其中PHA浓度为50μg/mL。

步骤（6）中所述的蛋白酶K消化液是由T4 DNA连接酶缓冲液稀释。0.01U/ uL的Sau3A I酶酶切缓冲液是由T4 DNA连接酶缓冲液稀释。

步骤（6）所述接头由引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2等量混合，之后采用无菌水稀释，终浓度为50ng/uL，然后90℃变性2min，55℃退火20min制得；

所述 SEQ ID NO:1具体为：5′ -GATCCTGAGCTCGAATTCGACCC-3′；

SEQ ID NO:2具体为5′-GGGTCGAATTCGAGCTCAG-3′。

6、如权利要求1所述尼罗罗非鱼性染色体DNA文库的构建方法，其特征是：步骤（7）中第一轮PCR采用的引物为SEQ ID NO:3，具体为

5′-GGGTCGAATTCGAGCTCAG-3′；

第二轮PCR采用的引物为SEQ ID NO:4，5′-GGGTCGAATTCGAGCTCAG- 3′。

步骤（7）中PCR扩增程序为95℃ 5min；94℃ 60s，50℃ 30s，72℃ 90s，35个循环； 72℃ 7min。

所述卡诺氏固定液为甲醇:冰醋酸按照体积比为3:1的混合溶液。

为了避免外源污染，上述整个染色体体外扩增操作过程均需在无菌条件下进行，所有的器械都经过严格高压和紫外灭菌，药品经过抽滤。并严格设立对照，以dH₂O为阴性对照，和以尼罗罗非鱼基因组DNA的酶切产物两端加相同的接头做为模板然后进行LA-PCR作为阳性对照。

本发明的有益效果：本发明所述方法具有标准化、操作简便的优点；本发明所述方法采用头肾细胞制作的染色体分离相中淋巴细胞比率远高于血细胞，因而保证同一视野内具有良好的染色体分离相，明显提升了制片效率；本发明所述方法中性染色体在高倍视野下与其他染色体能够显著区分；本发明所述方法切割稳定、重复性高，降低了尼罗罗非鱼性染色体的分离难度，提高文库构建的特异性。

附图说明

图1是尼罗罗非鱼头肾细胞染色体分离相图；

图2是尼罗罗非鱼性染色体切割分离图；

其中图2-a为性染色体标记图，2-b为性染色体切割图；

图3是尼罗罗非鱼性染色体扩增后的电泳图；

其中M为分子量标记，B为阴性对照，S为性染色体扩增产物。

具体实施方式

以下实施例中RMPI1640培养液购自Gibco公司；PHA、秋水仙素、蛋白酶K和姬姆萨原液购自购Solarbio公司；卡诺氏固定液以甲醇：冰醋酸=3:1的比例用临时配制；Sau3A I酶、T4 DNA连接酶缓冲液、LA-PCR反应试剂盒、产物纯化试剂盒、PMD19-T Vector、感受态细胞和X-gal和IPTG 购自Takara公司；罗非鱼血液基因组DNA提取采用SDS法提取；引物由基康生物技术有限公司合成；序列由基康生物技术有限公司测序。

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1

一种尼罗罗非鱼性染色体DNA文库的构建方法，包含以下步骤：

（1）尼罗罗非鱼头肾细胞培养：取体重50g以上的尼罗罗非鱼断尾排血20 min，然后将尼罗罗非鱼放入解剖盘，用干净的剪刀剪开鱼的头后部，用镊子取出头肾，将头肾组织放入装有0.8%的生理盐水的培养皿中，用生理盐水清洗 2～3 次，将100目的细胞筛放在装有10mL生理盐水的培养皿中，再将头肾组织放在筛网上，用注射器里平滑的推头轻轻研磨后，用少量的生理盐水冲洗筛网，将头肾细胞冲入培养皿中；然后用150目的细胞筛过滤一次，将细胞悬液装入15mL的离心管中，1200rpm离心10min，弃清液，加入的用过滤灭菌的RMPI 1640细胞培养液12mL，其中PHA浓度为50μg/mL，吸管吹打混匀，制成细胞悬液；将细胞悬液吸入25cm²培养瓶中，置于28℃、5% CO₂培养箱中，培养82h；细胞培养终止前2～3h滴加秋水仙素至终浓度为0.05mg/L，并轻轻摇动培养瓶使药物混匀。

（2）细胞低渗处理：摇动培养瓶使所有细胞悬浮在培养瓶中，将所有细胞悬液到入10mL锥形离心管中，用吸管吸取少许0.8%生理盐水，将培养瓶内残留的细胞洗出倒入离心管，轻轻吹打均匀，1500～2000rpm离心10min，轻轻吸出上清，仅留少许上清和细胞沉淀。然后在离心管中加入0.075% KCl溶液8mL并轻轻吹形成细胞悬液，37℃温育l h，使红细胞破碎，淋巴细胞膨胀。

（3）细胞固定：低渗处理后悬液1200rpm离心10min，吸去上清，吹打混匀后加入卡诺氏固定液(甲醇：冰醋酸=3:1) 2mL，吹打细胞悬液后4℃固定30min，1200rpm溶液离心10min，室温下重复固定两次。

（4）制片：固定液最后1次离心后吸出上清液，加入少许新鲜配制的固定液吹打成悬液，从冰箱的冷藏室内取出POL膜载玻片放置成45度角，从1m高处滴片，每片滴加悬液2～3滴，将膜放入70℃烘箱中放置30秒，干燥后用10%姬姆萨染色液扣染30min，然后用蒸馏水轻轻冲洗膜片，室温中晾干。

（5）染色体切割、分离：将步骤（4）制备好的POL膜载玻片放在激光显微切割仪载物台上，在40倍物镜下找到目标染色体，之后将视野进行标记，再寻找其他的分裂良好的分裂相，依次做好定位标记。在进行显微切割时，将物镜调到150倍油镜后，通过定位标记记录将视野调回到我们要找的分裂相，寻找到性染色体，对周围进行冷激光显微切割时，最终将性染色体完整的切下、保留在0.2mL的PCR管中。

如图1所示，在40倍物镜尼罗罗非鱼染色体分离相清晰可见；调至150倍油镜后，如图2所示，对标记的性染色体进行切割。

（6）酶切及接头连接：将分离的含有染色体的PCR管中加入20 μL反应缓冲液 (5 mg/L蛋白酶K缓冲液、1×T4 DNA连接酶缓冲液），然后12000 rpm离心15 min后55 ℃温浴3 h，75 ℃变性10 min；然后加入2 μL配制好的Sau 3A I酶切溶液（内切酶浓度为0.01 U/mL），37℃下酶切4h，70 ℃变性20 min；然后加入2 μL制备好的5 mg/L的接头；即SEQ ID NO:1，

5′-GATCCTGAGCTCGAATTCGACCC-3′、SEQ ID NO: 2，

5′-GGGTCGAATTCGAGCTCAG-3′，16℃过夜连接，然后70℃变性20min。

（7）扩增及回收：LA-PCR扩增分为两轮，第一轮取所有连接产物作为底物，引物为SEQ ID NO:3，5′-GGGTCGAATTCGAGCTCAG-3′，第二轮以第一轮扩增产物2 μL作为模板，引物为SEQ ID NO:4，

5′-GGGTCGAATTCGAGCTCAG-3′，扩增程序均为95℃ 5min；94℃ 60 s，50℃ 30 s，72℃ 90 s，35个循环； 72℃ 7 min。PCR反应体系: 10×PCR混合缓冲液5 µL，MgCl₂(25mM) 4µL，dNTPs(10mM) 4µL，引物(10µM)1µL，Taq酶1 U，补无菌去离子水至50µL。按说明书操作取得DNA纯化产物。

以dH₂O为阴性对照，和以尼罗罗非鱼基因组DNA的酶切产物两端加相同的接头做为模板然后进行LA-PCR作为阳性对照。如图3所示，阴性对照组无扩增产物，实验组扩增片段大小正确。

（8）步骤（7）回收的产物测序及片段分析，具体操作为：

质粒的转化：PMD19-T Vector和DNA纯化产物片段摩尔比为1:5，16℃连接过夜。取感受态细胞100μL，加入上述连接好的反应溶液，混合均匀，在冰浴中静置30min，42℃水浴中热激90s，立即转移至冰浴中，静置2～3min，每管加入无抗生素的普通LB培养基200μL，置于37℃，180r/min振荡培养温箱中培养40～60min。

阳性克隆筛选：分别取X-gal(50mg/mL)16μL和 IPTG (200mg/mL) 4μL混合均匀，加入到含Amp的琼脂平板上，用无菌玻璃涂布器将X-gal和IPTG混合液均匀涂布于整个平板表面。放置10～15min直至所有液体被吸收。

取上述转化的菌液100μL，均匀地涂布于整个平板表面，放置15～30min，使液体充分被吸收。封口，倒置平板于37 ℃培养12～16h。终止培养后置于4 ℃冰箱里2～4h，使蓝斑充分显现，备用。

菌落PCR检测：用无菌牙签挑取白斑于20μL的LB液体培养基中，混匀做模板，用载体通用引物M13F和M13R进行PCR检测，反应条件为95℃ 5min；94℃ 60 s，50℃ 30 s，72℃ 90 s，35个循环；72℃ 7min。反应结束后，取5μL反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳观察。

片段测序与序列分析：随机挑选菌落PCR鉴定正确的克隆，将阳性克隆测序，确定PCR产物序列，并在GenBank上进行BLAST比对。

序列表

<210> SEQ ID NO: 1

<211> 23

<212> DNA

SEQ ID NO:1

5′-GATCCTGAGC TCGAATTCGA CCC-3′

<210> SEQ ID NO: 2

<211> 28

<212> DNA

SEQ ID NO: 2

5′-GGGTCGAATTCGAGCTCAG-3′

<210> SEQ ID NO: 3

<211> 26

<212> DNA

SEQ ID NO:3

5′-GGGTCGAATTCGAGCTCAG-3′

<210> SEQ ID NO: 4

<211> 26

<212> DNA

SEQ ID NO:4

5′-GGGTCGAATTCGAGCTCAG-3′

<210> SEQ ID NO: 5

<211> 861

<212> DNA

SEQ ID NO:5

TCGGTACGCG CGGATCTTCC AGAGATAATC GTCGAACGGC AGGCGTGCAA ACTTGGCGTA 60

ATCATGGTCA TAGCTGTTTC CTGTGTGAAA TTGTTATCCG CTCACAATTC CACACAACA 120

TACGAGCCAA GCATAAAGTG TAAAGCCTGG GGTGCCTAAT GAGTGAGCTA ACTCACATTA 180

ATTGCGTTGC GCTCACTGCC CGCTTTCCAG TCGGGAAACC TGTCGTGCCA GCTGCATTAA 240

TGAATCGGCC AACGGGGGGA GAGGCGGTTT GCGTATTGGG CGCTCTTCCG CTTCCTCGCT 300

CACTGACTCG CTGCGCTCGG TCGTTCGGCT GCGGCGAGCG GTATCAGCTC ACTCAAAGG 360

CGGTAATACG GTTATCCACA GATAGGGGAT AACGCAGGAA AGAACATGTG AGCAAAAGGC 420

CAGCAAAAGG CCAGGAACCG TAAAAAGGCC GCGTTGCTGG CGTTTTTCCA TAGGCTCCGC 480

CCCCCTGACG AGCATCACAA AAATCGAGCT AAGTCAGAGG TGGCGAAACC CGACAGGACT 540

ATAGATACCA GGCGTTTCCC CCTGGAAGCT CCCTCGTGCG CTCTCCTGTT CCGACCCTGC 600

CGCTTACCGG ATACCTGTCC GCCTTTCTCC CTCGGAAGCG TGGCGCTTTC TCATAGCTCA 660

CGCTGTAGGT ATCTCAGTTC GGTGTAGGTC GTTCGCTCCA AGCTGGGCTG TGTGCACGAA 720

CCCCCCGTTC AGCCCGACCG CTGCGCCTTA TCCGGTACTA TCTCTTGAGT CCAACCCGGT 780

AAGACACGAC TTATCGCCAC TGGCAGCAGC CACTGGTAAC AGGATTAGCA GAGCGAGGTA 840

TGTAGGCGGT GCTACAGAGT T 861

<210> SEQ ID NO: 6

<211> 941

<212> DNA

SEQ ID NO:6

GTACGCGCGG ATCTTCCAGA GATTATCGTC GAACGGCAGG CGTGCAAACT TGGCGTAATC 60

ATGGTCATAG CTGTTTCCTG TGTGAAATTG TTATCCGCTC ACAATTCCAC ACAACATACG 120

AGCCGGACAT AAAGTGTAAA GCCTGGGGTG CCTAATGAGT GAGCTAACTC ACATTAATTG 180

CGTTGCGCTC ACTGCCCGCT TTCCAGTCGG GAAACCTGTC GTGCCAGCTG CATTAATGAA 240

TCGGCCAACG CGCGGAGAGG CGGTTTGCGT ATTGGGCGCT CTTCCGCTTC CTCGCTCACT 300

GACTCGCTGC GCTCGGTCGT TCGGCTGCGG CGAGCGGTAT CAGCTCACTC AAAGGCGGTA 360

ATACGGTTAT CCACAGAATA GGGATAACGC AGGAAAGAAC ATGTGAGCAA AAGGCCAGCA 420

AAAGGCCAGG AACCGTAAAA AGGCCGCGTT GCTGGCGTTT TTCCATAGGC TCCGCCCCCC 480

TGACGAGCAT CACAAAAATC GACGCCAATC AGAGGTGGCG AAACCCGACA GGACTATAAA 540

GATACCAGGC GTTTCCCCCT GGAAGCTCCC TCGTGCGCTC TCCTGTTCCG ACCCTGCCGC 600

TTACCGGATA CCTGTCCGCC TTTCTCCCTT CGGAACGTGG CGCTTTCTCA TAGCTCACGC 660

TGTAGGTATC TCAGTTCGGT GTAGGTCGTT CGCTCCAAGC TGGGCTGTGT GCACGAACCC 720

CCCGTTCAGC CCGACCGCTG CGCCTTATCC GGTAACTTCG TCTGAGTCCA ACCCGGTAAG 780

ACACGACTTA TCGCCACTGG CAGCAGCCAC TGGTAACAGG ATTAGCAGAG CGAGGTATGT 840

AGGCGGTGCT ACAGAGTTCT TGAAGTGGTG GCCTAACTAC GGCACACTAA AGAACAGTAT 900

TTGGTATCTG CGCTCTGCTG AAGCCAGTTA CCTTCGGAAA AAGAGTT 941

<210> SEQ ID NO: 2

<211> 947

<212> DNA

SEQ ID NO:7

GTACGCGCGG ATCTTCCAGA GATTATCGTC GAACGGCAGG CGTGCAAACT TGGCGTAATC 60

ATGGTCATAG CTGTTTCCTG TGTGAAATTG TTATCCGCTC ACAATTCCAC ACAACATACG 120

AGCCGGACAT AAAGTGTAAA GCCTGGGGTG CCTAATGAGT GAGCTAACTC ACATTAATTG 180

CGTTGCGCTC ACTGCCCGCT TTCCAGTCGG GAAACCTGTC GTGCCAGCTG CATTAATGAA 240

TCGGCCAACG CGCGGAGAGG CGGTTTGCGT ATTGGGCGCT CTTCCGCTTC CTCGCTCACT 300

GACTCGCTGC GCTCGGTCGT TCGGCTGCGG CGAGCGGTAT CAGCTCACTC AAAGGCGGTA 360

ATACGGTTAT CCACAGAATA GGGATAACGC AGGAAAGAAC ATGTGAGCAA AAGGCCAGCA 420

AAAGGCCAGG AACCGTAAAA AGGCCGCGTT GCTGGCGTTT TTCCATAGGC TCCGCCCCCC 480

TGACGAGCAT CACAAAAATC GACGCCAATC AGAGGTGGCG AAACCCGACA GGACTATAAA 540

GATACCAGGC GTTTCCCCCT GGAAGCTCCC TCGTGCGCTC TCCTGTTCCG ACCCTGCCGC 600

TTACCGGATA CCTGTCCGCC TTTCTCCCTT CGGAACGTGG CGCTTTCTCA TAGCTCACGC 660

TGTAGGTATC TCAGTTCGGT GTAGGTCGTT CGCTCCAAGC TGGGCTGTGT GCACGAACCC 720

CCCGTTCAGC CCGACCGCTG CGCCTTATCC GGTAACTTCG TCTGAGTCCA ACCCGGTAAG 780

ACACGACTTA TCGCCACTGG CAGCAGCCAC TGGTAACAGG ATTAGCAGAG CGAGGTATGT 840

AGGCGGTGCT ACAGAGTTCT TGAAGTGGTG GCCTAACTAC GGCACACTAA AGAACAGTAT 900

TTGGTATCTG CGCTCTGCTG AAGCCAGTTA CCTTCGGAAA AAGAGTT 947