对4种曲霉菌同步定量和基因分型的二聚体突变荧光引物定量PCR方法与流程

本发明属于生物检测领域，具体地说，是一种基于二聚体突变引物建立的荧光定量PCR方法定量检测曲霉菌并同步进行基因分型的方法。

背景技术：

曲霉菌包括132个种和18个变种，占空气中真菌的12％左右，是通过空气传播的常见霉菌，早在1848年就被视为感染根源，不仅会影响人和动物的健康，，还会给农业生产带来巨大的损失。

近年来，随着在器官、骨髓和造血干细胞移植，HIV，肿瘤放化疗等所导致的免疫力低下患者增多，条件致病菌——曲霉菌引起的侵袭性真菌感染逐年升高，临床上最常见的是烟曲霉(A.fumigatus)，黄曲霉(A.flavus)，土曲霉，黑曲霉(A.niger)，杂色曲霉(A.versicolor)，等，其中黄曲霉的致病率占90％。

虽然已有大量的抗真菌药物上市，但缺乏早期的快速准确的检测曲霉菌的实验室方法，致使临床曲霉病的病死率居高不下(>30％)，若未及时治疗，病死率可达90％以上。而临床上对曲霉菌病的治疗费用昂贵，许多患者会放弃治疗。故一种早期快速准确的诊断曲霉菌的实验室诊断方法，可以有效降低曲霉病病死率和医疗负担。

传统的曲霉菌检测方法有培养法、影像学检查、组织病理学检查等方法，如大部分实验室需要根据真菌的菌落表现特征以及显微镜下特征性的分子孢子头和足细胞来鉴定，过程需要7～14天。传统的检测方法存在检测时间长，阳性率低等缺陷。另外也有一些非传统的检测方法，如乳胶凝集法、半乳甘露聚糖法等，乳胶凝集法存在检测敏感度低及假阳性率高等问题；众多学者对半乳甘露聚糖法的特异性和灵敏性高低存在争论。随着技术的发展，PCR方法进入到临床检测领域，特别是实时荧光定量PCR(real-time polymerase chain reaction，real-time PCR)技术的应用，不仅可以早期准确检测，还可以进行定量和分型检测。

Real-time PCR分为内掺式染料技术和探针技术两类。内掺式染料技术采用的染料一般为溴化乙啶、YO-PRO 1和SYBR Green。其原理是利用游离DNA染料不发射荧光，而与双链DNA结合后，荧光值大大增强，从而进行DNA定量。并且还可通过荧光信号监测产物解链温度差异，进行熔解曲线分析，根据不同DNA产物会产生不同的熔解曲线，而实现基因分型。其优势在于能够监测任何双链DNA，只需设计普通引物，使检测方法简化，成本低。但也正是由于染料能够与任何双链DNA结合，因此其也能和非特异性产物如引物二聚体、非特异扩增产物、双链模板等结合，产生非特异荧光信号，降低了特异性，故不适于临床检测。

探针技术采用了基于荧光淬灭原理或荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)的探针，包括TaqMan探针、Amplifluor探针、分子信标、蝎型探针等。这些探针均是在与模板互补的同一寡核苷酸链上，分别标记荧光基团和淬灭基团，每一次扩增中通过水解或者杂交等方式破坏两者之间的FRET，从而发出与扩增产物数等量的荧光信号，故其特异性高，定量准确，因而广泛应用于科研和临床诊断中。但这些探针属于多标记探针，其合成难度和成本较高，制约了其推广应用。不少研究人员试图采用单标记探针来降低合成难度和成本，如杂交探针(hybridization probes)和荧光置换探针(displacing probes)^[12]，取得了较好效果。但为防止探针与靶序列杂交引起自身延伸而被破坏，仍然需要在探针末端磷酸化来阻断其延伸，因此，并非真正意义的单标记探针技术。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种对4种曲霉菌同步定量和基因分型的二聚体突变荧光引物定量PCR方法。

基于二聚体突变引物技术建立的荧光定量PCR方法的工作原理：

将荧光报告基团标记在一条引物的5’端，称为上游引物，淬灭基团标记在与荧光引物互补的寡核苷酸链的3’端上，称为上游引物互补链，在上游引物互补链序列中，人为设计一个碱基突变；另外还设计一条和靶基因另一端互补的引物，称为下游引物；将三种寡核苷酸链加入PCR反应体系，无靶基因时，两者将相互结合形成二聚体，产生荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)，不会发射荧光；一旦存在靶基因，由于荧光引物与靶基因完全互补，而上游引物互补链存在1个突变碱基，在较高温度下，荧光引物与靶基因的亲和力大于与上游引物互补链间的亲和力，从而优先和靶基因结合，在PCR体系中发挥普通引物引导延伸的功能，标记的荧光基团随引物整合在新生PCR产物中起探针的指示作用，所有新生PCR产物均被荧光基团标记，此时，FRET被破坏，反映PCR产物量的荧光信号可被实时定量检测；通过荧光信号监测产物解链温度差异，进行熔解曲线分析，实现基因分型。

上述技术方案的原理：将荧光报告基团标记在引物上，而淬灭基团标记在与荧光引物互补的寡核苷酸链上，即两条互补的寡核苷酸只分别标记了相应的淬灭或者报告基团。这种结构设计可巧妙地回避对淬灭链末端进行封闭，因为它虽与引物互补，而3’端已被淬灭基团阻断，而PCR不能从5’端延伸，所以不需要对5’端进行磷酸化阻断；而引物仅5’端标记了荧光报告基团，引物与靶基因结合后，可从3’端延伸完成靶基因复制进行定量；扩增完成后由于引物标记有荧光基团，新生的DNA产物将被荧光基团示踪，如果扩增的DNA有碱基差异或长度差异，进行熔解曲线分析时，可以将不同序列的产物按熔解温度差异区分出来，实现基因分型(结构和工作原理见图1)。

这样的设计实现了真正的单标记结构，故合成、纯化简单且成本低，克服了普通多标记探针法成本高的难题。是一种高通用性、高特异性和灵敏性、操作简单、价廉的新型real-time PCR技术，不但具有探索性和创新性，还具有临床应用价值，可望产生良好的社会效益和经济效益。故我们成功的将这种方法应用于曲霉菌的检测中去，实现了定量检测和基因分型。

本发明利用生物信息学分析寻找适合曲霉菌(烟曲霉菌、黑曲霉菌、黄曲霉菌和土曲霉菌)定量和分型的序列，采用PRIMER EXPRESS 2.0软件设计可同时定量和分型的一对引物及标记猝灭基团的互补链。提取DNA后，以最适的体系和循环条件在荧光定量PCR仪上进行扩增，同时本发明采用取黑曲霉菌DNA构建定量的标准质粒。最终通过分析扩增曲线和溶解曲线，实现对4种曲霉菌同时定量和分型。

具体包括以下步骤：

(1)生物信息学分析寻找适合曲霉菌定量和分型的序列设计引物和互补链序列

在GenBank数据库获取得4种曲霉菌(烟曲霉菌、黑曲霉菌、黄曲霉菌和土曲霉菌)基因组序列的登录号，选择5.8srRNA、28srRNA基因、ITS区的DNA序列，通过核酸分析软件DNAman寻找出适合定量和分子分型的DNA区域(图2)。PRIMER EXPRESS 2.0软件设计可同时定量和分型的一对引物：

上游引物：5'-FAM-CCCTACCTGATCCGAGGTCAACC-3'(SEQ ID No.1)；

下游引物：5'-AAAGTAAGACAGGAAATGTG-3'(SEQ ID No.2)。

上游引物互补链：GGTTGACCTCGAATCAGGTAGGG-Dabcyl-3'

(SEQ ID No.3)，引物中碱基以斜体标记的序列是人为设计碱基突变，使引物和互补链不完全匹配。

进一步地，本发明的荧光报告基团可供选择的有6-FAM、TET、HEX、JOE、CY3、CY5、TAMRA、Texas Red，荧光淬灭基团有BHQ-1、BHQ-2、Lowa Black^TMRQ、Lowa Black^TMFQ、Dabcy1。

(2)真菌培养和DNA提取

从广东省菌种保存中心购买曲霉菌的标准菌株：烟曲霉菌(ATCC 36607)，黑曲霉(ATCC 16888),黄曲霉(ATCC 16883)和土曲霉(ATCC 16792)，沙堡弱培养基培养后，用真菌DNA提取试剂盒提取DNA。

(3)构建定量的标准质粒

用普通PCR法扩增黑曲霉菌的分型和定量序列，纯化DNA，pMD-18T质粒TA克隆，转化大肠埃希菌DH5α。测序鉴定后，对阳性克隆菌进行增菌繁殖，纯化获取大量重组质粒作为DNA模板，为real-time PCR方法的建立提供可靠的DNA标准品。

上游引物序列：5'-CCCTACCTGATCCGAGGTCAACC-3'(SEQ ID No.1)；

下游引物序列：5'-AAAGTAAGACAGGAAATGTG-3'(SEQ ID No.2)。

(3)Real-time PCR体系和循环参数

扩增体系为：

循环条件为：

(4)绘制标准曲线和建立曲霉菌real-time PCR分子分型的标准熔解曲线图谱

绘制标准曲线：标准质粒10倍倍比稀释成10⁷-10¹copies/ml浓度梯度，计算机自动绘制标准曲线。

标准熔解曲线图谱的建立：定量检测扩增完成后，进行熔解曲线分析。同时对4种标准菌株的检测，进行熔解曲线分析，获取它们自身特异的熔解曲线图谱，建立真菌分型的标准熔解曲线图谱。从左至右代表黑曲霉(A.niger)，黄曲霉(A.flavus)，烟曲霉(A.fumigatus)，土曲霉(A.terreus)，解链温度分别为：82.42℃，83.90℃，84.35℃，85.81℃(见图4)。

在本发明的一个实施例中，采用上述法对曲霉菌的标准菌株和白假丝酵母菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌标准菌株、志贺菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌以及伤寒沙门菌提取DNA后用建立的方法进行检测，分析Real-time PCR检测的特异性，结果显示具有很好的特异性。

在本发明的另一个实施例中，通过对3个系列标准品(1×10⁴～1×10¹²copies/ml)和一种浓度临床样品重复做5个平行管，定量结果计算SD和CV，进行批内重复性检测，结果显示具有很好的重复性。

本发明还提供一种对烟曲霉菌、黑曲霉菌、黄曲霉菌和土曲霉菌同步定量和基因分型的检测试剂盒，所述试剂盒包括用于扩增适合曲霉菌定量和分型的序列的引物，其中：

上游引物：5'-FAM-CCCTACCTGATCCGAGGTCAACC-3'(SEQ ID No.1)，

下游引物：5'-AAAGTAAGACAGGAAATGTG-3'(SEQ ID No.2)，

上游引物互补链：5’-GGTTGACCTCGAATCAGGTAGGG-Dabcyl-3'(SEQ ID No.3)，互补链中碱基以斜体标记的序列是人为设计碱基突变，使上游引物和互补链不完全匹配。

所述的试剂盒，上游引物5’端标记的荧光报告基团可以是6-FAM、TET、HEX、JOE、CY3、CY5、TAMRA、Texas Red中的任意一种，上游引物互补链3’端标记的荧光淬灭基团可以是BHQ-1、BHQ-2、Lowa Black^TMRQ、Lowa Black^TMFQ、Dabcy1中的任意一种。

本发明的另一个目的是提供上述试剂盒在用于检测和基因分型烟曲霉菌、黑曲霉菌、黄曲霉菌和土曲霉菌的产品中的应用。

本发明基于上述设计方案，可利用一对引物——一条含有报告荧光集团的上游引物，一条和上游互补的淬灭荧光基团的引物、一条普通下游引物，在同一PCR反应体系中，同时对4种曲霉菌定量检测和基因分型。该法的各项技术指标经评价都达到临床要求，方法具有灵敏度高、特异性好、检测速度快、操作简便、成本低廉等优点，可用于临床诊断、治疗监测和预后判断和流行病学调查，具有较高的临床诊断价值，适于推广应用。

附图说明

图1是基于二聚体突变引物技术建立的荧光定量PCR方法工作原理图；

i:二聚体荧光突变引物与模板DNA，由于荧光共振能量转移(FRET)作用，荧光基团被抑制；ii:变性时，包括二聚体荧光突变引物的所有双链DNA解链,FRET也被破坏；iii:退火时，引物复性优先与完全互补的靶基因结合；iv:产物延伸阶段；v:再次变性；荧光基团掺入新生链,此时FRET消失荧光信号被检测到，同时可进行熔解曲线分析。

图2是对曲霉菌定量和分型序列和引物位置的示意图；

图3是不同浓度标本荧光定量PCR扩增标准曲线；

图4是4种曲霉菌基因分型标准熔解曲线图谱；

熔解曲线从左至右代表黑曲霉A.niger(82.42)，黄曲霉A.flavus(83.90)，烟曲霉A.fumigatus(84.35)，土曲霉A.terreus(85.81)，括弧数值代表熔解温度。

图5是显示特异性和重复性荧光扩增图；

左图：除阳性黑曲霉菌对照有荧光扩增曲线外，白假丝酵母菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌标准菌株、志贺菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、伤寒沙门菌均无扩增曲线。右图：1×10⁴～1×10²copies/ml的标准品5次重复荧光扩增曲线。

图6是4株临床菌株测定的扩增曲线和溶解曲线图；

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

【实施例1】4种曲霉菌的定量和基因分型检测

扩增体系的准备：

(1)所需试剂：PCR-mix buffer(Takara)，模板DNA

(2)引物混合液：为各2.0μM的三条引物组成的混合液

1.真菌培养和DNA提取

将标准菌株烟曲霉菌(ATCC 36607)，黑曲霉(ATCC 16888),黄曲霉(ATCC 16883)和土曲霉(ATCC 16792)，利用沙堡弱培养基培养后，用真菌DNA提取试剂盒提取DNA。

2.构建定量的标准质粒

用普通PCR法扩增黑曲霉菌DNA序列：

上游引物序列为：5'-CCCTACCTGATCCGAGGTCAACC-3'(SEQ ID No.1)；

下游引物序列为：5'-AAAGTAAGACAGGAAATGTG-3'(SEQ ID No.2)。

扩增条件和体系同Real-time PCR。

将扩增产物纯化(Axygen PCR产物纯化试剂盒)，pMD-18T质粒TA克隆，转化大肠埃希菌DH5α(参考Takara pMD-18T vector说明书步骤)。测序(华大基因测序)鉴定后，对阳性克隆菌进行增菌繁殖，纯化获取大量重组质粒作为后续real-time PCR方法的DNA标准品。

3.Real-time PCR

以提取的各菌株DNA和前面所制作的标准质粒为模板，按照下面体系和循环条件进行扩增：

扩增体系为：

循环条件为：

4.绘制标准曲线

标准质粒10倍倍比稀释成10⁷-10¹copies/ml浓度梯度，计算机自动绘制标准曲线。本实验所建立的标准曲线R值大于0.99，具有优秀的线性，见图3：从左至右代表的浓度为1×10⁷～1×10¹copies/ml。

5.基因分型结果判定

PCR循环扩增产物后，不同曲霉菌DNA序列的熔解温度不同，示踪的荧光基团解离后，荧光值发生改变，从而4种不同曲霉菌的DNA序列会得到不同的荧光曲线，本法基因分型结果与测序结果完全一致，4种曲霉菌基因分型熔解曲线见图4。

【实施例2】对本方法进行特异性和重复性分析

特异性：采用本法对曲霉菌的标准菌株和白假丝酵母菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌标准菌株、志贺菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌以及伤寒沙门菌提取DNA后用建立的方法进行检测，分析Real-time PCR检测的特异性，扩增曲线见图5左。

重复性：批内重复性通过对3个系列标准品(1×10⁴～1×10²copies/ml)和1.5×10³浓度临床样品重复做5个平行管，定量结果计算SD和CV。

标准质粒1×10²～1×10⁴copies/ml，SD分别：0.707,0.1845，0.3172，CV分别为：4.79％，5.83％，4.94％，扩增曲线见图5右。

临床样品浓度为1.5×10³copies/ml，SD：0.1283，CV：6.25％，

本法特异性和重复性均较好。

【实施例3】4株临床菌株的测定

根据上述描述的方法，我们从临床搜集了经生化验证的四株不同类型的曲霉菌进行检测。扩增曲线和溶解曲线的结果如图6所示，本发明可同步的定量检测4种不同类型的曲霉菌。

图6左：扩增曲线从左至右分别是黄曲霉、烟曲霉、黑曲霉、土曲霉；

图6右：熔解曲线从左至右代表黑曲霉，黄曲霉，烟曲霉，土曲霉。

SEQUENCE LISTING

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