对4种曲霉菌同步定量和基因分型的二聚体突变荧光引物定量PCR方法与流程

技术特征：

1.一种对烟曲霉菌、黑曲霉菌、黄曲霉菌和土曲霉菌同步定量和基因分型的二聚体突变荧光引物定量PCR方法，其特征在于，该方法中：

上游引物：5'-FAM-CCCTACCTGATCCGAGGTCAACC-3'(SEQ ID No.1)，

下游引物：5'-AAAGTA AGACAGGAAATGTG-3'(SEQ ID No.2)，

上游引物互补链：5’-GGTTGACCTCGAATCAGGTAGGG-Dabcyl-3'(SEQ ID No.3)，互补链中碱基以斜体标记的序列是人为设计碱基突变，使上游引物和互补链不完全匹配。

2.根据权利要求1所述的对烟曲霉菌、黑曲霉菌、黄曲霉菌和土曲霉菌同步定量和基因分型的二聚体突变荧光引物定量PCR方法，其特征在于，该方法具体为：

1)提取待检测样品及4种标准菌株中的DNA；

2)制备阳性质粒标准品；

3)运行荧光定量PCR；

4)数据分析。

3.根据权利要求1所述的对烟曲霉菌、黑曲霉菌、黄曲霉菌和土曲霉菌同步定量和基因分型的二聚体突变荧光引物定量PCR方法，其特征在于，上游引物5’端标记的荧光报告基团可以是6-FAM、TET、HEX、JOE、CY3、CY5、TAMRA、Texas Red中的任意一种，上游引物互补链3’端标记的荧光淬灭基团可以是BHQ-1、BHQ-2、Lowa Black^TMRQ、Lowa Black^TMFQ、Dabcy1中的任意一种。

4.根据权利要求2所述的对烟曲霉菌、黑曲霉菌、黄曲霉菌和土曲霉菌同步定量和基因分型的二聚体突变荧光引物定量PCR方法，其特征在于，所述步骤2)中用普通PCR法扩增黑曲霉菌的分型和定量序列，纯化DNA，pMD-18T质粒TA克隆，转化大肠埃希菌DH5α，测序鉴定后，对阳性克隆菌进行增菌繁殖，纯化获取重组质粒作为DNA模板，为real-time PCR方法的建立提供DNA标准品，

上游引物序列：5'-CCCTACCTGATCCGAGGTCAACC-3'(SEQ ID No.1)；

下游引物序列：5'-AAAGTA AGACAGGAAATGTG-3'(SEQ ID No.2)。

5.根据权利要求2所述的对烟曲霉菌、黑曲霉菌、黄曲霉菌和土曲霉菌同步定量和基因分型的二聚体突变荧光引物定量PCR方法，其特征在于，所述步骤3)中扩增体系为：

循环条件为：

6.一种对烟曲霉菌、黑曲霉菌、黄曲霉菌和土曲霉菌同步定量和基因分型的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于扩增适合曲霉菌定量和分型的序列的引物，其中：

上游引物：5'-FAM-CCCTACCTGATCCGAGGTCAACC-3'(SEQ ID No.1)，

下游引物：5'-AAAGTA AGACAGGAAATGTG-3'(SEQ ID No.2)，

上游引物互补链：5’-GGTTGACCTCGAATCAGGTAGGG-Dabcyl-3'(SEQ ID No.3)，互补链中碱基以斜体标记的序列是人为设计碱基突变，使上游引物和互补链不完全匹配。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，上游引物5’端标记的荧光报告基团可以是6-FAM、TET、HEX、JOE、CY3、CY5、TAMRA、Texas Red中的任意一种，上游引物互补链3’端标记的荧光淬灭基团可以是BHQ-1、BHQ-2、Lowa Black^TMRQ、Lowa Black^TMFQ、Dabcy1中的任意一种。

8.如权利要求6所述的试剂盒在制备用于检测和基因分型烟曲霉菌、黑曲霉菌、黄曲霉菌和土曲霉菌的产品中的应用。