基于眼肌面积为首选性状的肉牛早期选种方法与流程

技术特征：

1.一种基于眼肌面积为首选性状的肉牛早期选种方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)利用超声波技术对待测犊牛进行眼肌面积检测，计算眼肌面积数值；

(1.1)在待选犊牛群体中对犊牛进行保定，以确保其自然站立；

(1.2)测量时探头放上耦合剂，剪掉测量部位毛，探头直接放在体表；腰肌面积在横断面第十二、十三肋间测量，腰肌面积是一个圆周测量；在识别超声影像时首先确定皮肤界面、脂间结缔组织和背最长肌肌膜所产生的3～4条强回声影带，然后确定眼肌四周肌膜的强回声影像，以确定眼肌面积周界；观察并调节屏幕影像，调节灰度、对比度、增益度，使近场增大，远场减小，获得理想影像时即冻结影像，并加注说明资料影像打印或存贮处理；图像读取时先确定上下界即椭圆短轴，然后确定两端界点即为椭圆长轴；此时屏幕上显示的平方厘米值就是近似椭圆形的眼肌的面积；

(2)利用HRM技术对目标基因进行基因分型；

(2.1)设计目标基因序列的扩增引物，确立最佳PCR反应条件；

(2.2)进行HRM分型，根据标准化曲线区分出不同的基因型，然后从每个基因型中选取2-3个样品进行普通的PCR扩增；

(2.3)PCR产物回收、测序，判断目标基因型；

(3)待选牛体重测定；

为空腹24小时后的体重；

(4)待选牛体尺测量；

体尺测量指标涉及体长、胸围；

(5)依照牛体型外貌评定标准，对待选牛外貌进行评分；

(6)根据上述步骤(1)至步骤(5)的测定结果，建立早选指数计算公式；

早选指数ESI＝眼肌面积×0.35+基因标记×0.25+体重指数×0.20+体躯指数×0.15+外貌指数×0.05；结合上述5项指标的加权值，依据早选指数公式

得出早选指数值，然后根据早选指数进行排序，选留数值高的个体；公式中，P_n为该性状的个体表型值，为该性状的个体表型值的平均值，w_i为个体性状的经济重要性，h²为遗传力。

2.根据权利要求1所述的基于眼肌面积为首选性状的肉牛早期选种方法，其特征在于：步骤(2.1)所述的设计目标基因序列的扩增引物，确立最佳PCR反应条件，具体是：

H-FABP基因5‘UTR上游引物序列：5’-TCTGCGTCTTTCCCAACCTA-3’

H-FABP基因5‘UTR下游引物序列：5’-GGCTCCCCAACCT GAC-3’

通过梯度PCR试验确定最佳试验温度，在200μL的PCR离心管中加入PCR反应扩增体系：2×PCR mix 10μL，上下游引物各0.2μL，DNA 0.5μL，用双蒸水ddH₂O补齐至20μL；其中，2×PCR mix表示2倍PCR反应体系混合溶液；

将PCR管置于PCR仪中，设定反应条件为95℃预变性4min；95℃变性40s；设置55℃-65℃梯度退火30s；70℃延伸30s，从第二步开始35个循环；72℃延伸10min；4℃保存；取5μL PCR产物与6×上样缓冲液混合后，用浓度为1％琼脂糖凝胶在1×TAE中电泳检测30min；根据条带亮度及清晰度确定最终退火温度；其中，6×上样缓冲液表示6倍上样缓冲液；1×TAE缓冲液的配置：先配置50×TAE缓冲液：Tris 242g，冰乙酸57.1m1,0.5M EDTA(pH 8.0)100m1，加水至1000ml，然后稀释50倍以后即可得到1×TAE缓冲液；

在96孔PCR管中加入HRM反应扩增体系：取2×Master Mix 10μL加入上下游引物各0.5μL，MgCl2 2μL(2.5mM)，DNA 1μL(试验前将DNA稀释至50ng/μL)，用ddH₂O补齐至20μL；其中，2×Master Mix表示2倍荧光定量PCR反应体系混合溶液；MgCl₂ 2μL(2.5mM)表示2.5毫摩尔每升的MgCl₂溶液2微升；

冰上操作，充分混匀后封膜离心30s，放入荧光定量PCR仪；

PCR反应条件为：95℃10min，95℃10s，57℃退火15s，72℃20s，从第二步开始45 个循环；95℃1min，40℃1min，65℃1s，然后温度以5℃/s的速率从65℃递增到95℃，最后温度降到40℃。

3.根据权利要求1所述的基于眼肌面积为首选性状的肉牛早期选种方法，其特征在于：步骤(2.2)所述的进行HRM分型，根据标准化曲线区分出不同的基因型，然后从每个基因型中选取2-3个样品进行普通的PCR扩增，具体是：

在200μL的PCR离心管中加入PCR反应扩增体系：10×PCR Buffer with MgCl2 6.25μL，dNTP Mixture(10mm)2.25μL，下游引物各1μL，Taq DNA polymerase(2U/μL)1.5μL，DNA 1μL，最后用ddH₂O补齐至50μL；其中，10×PCR Buffer with MgCl₂表示含有MgCl₂的10倍PCR缓冲液；dNTP Mixture(10mM)表示10毫摩尔每升的dNTP混合液；Taq DNA polymerase(2U/μL)表示2单位每微升的taqDNA酶；ddH₂O表示双蒸水；

将PCR管置于PCR仪中，设定反应条件为95℃预变性4min；95℃变性40s；退火30s；70℃延伸30s，从第二步开始35个循环；72℃延伸10min；4℃保存；取5μL PCR产物与6×上样缓冲液混合后，用1％琼脂糖凝胶在1×TAE中电泳检测，电压7～10V/cm，当溴酚蓝电泳至2～4cm，在紫外灯下观察结果并用凝胶成像仪照相，PCR产物清晰且与预期大小一致的个体为符合要求个体，进行下一步分析。

4.根据权利要求1所述的基于眼肌面积为首选性状的肉牛早期选种方法，其特征在于：步骤(2.3)所述的PCR产物测序，判断目标基因型，具体是：取每个样品的PCR产物10μL，送测序公司测序；测序后，结合测序结果与分型的HRM标准曲线图，作为基因分型的判断依据，利用标准曲线图进行HRM基因分型，而后进行后期的计算。