靶向HBC二聚体形成的药物筛选细胞模型及其构建和应用的制作方法

本发明属于分子生物学领域，涉及一种药物筛选细胞模型，具体涉及一种靶向HBC二聚体形成的药物筛选细胞模型及其构建和应用。
背景技术：
：乙型肝炎病毒(HBV)感染是一个严重的公共卫生问题，其涉及范围广泛，全球有近4亿慢性感染患者，而慢性HBV感染可以导致肝硬化、肝细胞癌等严重后果，每年因此死亡者近百万。HBV为直径42nm的球形颗粒，呈双层壳结构，外壳主要由三种表面蛋白(HBs)构成，内层核衣壳由核心蛋白(HBC)组成，为正20面体结构，该结构包含90或120个HBC二聚体，每个二聚体由两个HBC单体组成。HBC在HBV复制过程中必不可少，它所构成的核衣壳是包装pgRNA和病毒聚合酶的场所，另外，HBC还介导病毒基因组DNA进入细胞核，继而生成cccDNA作为复制的初始模板。由于核衣壳对于HBV复制周期的完成不可或缺，因此，干扰核衣壳的正常形成也成为一种很有吸引力的治疗策略。干扰核衣壳的形成，可以从两个方面来考虑，一是干扰二聚体之间的相互作用，使得最终形成的核衣壳结构异常；二是干扰HBC单体之间形成二聚体，破坏核衣壳的结构基础，从而阻碍核衣壳的形成。现有一些处于临床前阶段的药物如HAPs，AT130，AT61等的作用机制是第一种，但目前尚缺乏靶向HBC二聚体形成的候选药物。研发靶向HBC二聚体形成药物的难点之一，是缺乏合适的药物筛选细胞模型。一个好的筛选模型，需要满足如下条件：(1)靶点明确；(2)所模拟的生物过程最大程度地接近自然状态；(3)检测过程简单方便。然而，目前为止，还没有一种模型能够满足这些要求。目前使用的筛选模型，要么是一些支持HBV复制的稳定细胞系，比如HepAD38，Hep2.2.15细胞等，它们的缺点是靶点不明确，检测较繁琐；要么使用原核表达的核心蛋白进行体外组装，这种模型的缺点是与真正病毒的复制环境差别较大。申请人在前期专利申请中(专利申请公开号CN106188310A)建立了一种能指示HBC二聚体形成的新方法。该方法的核心策略是：利用两个蛋白单体形成二聚体后，物理距离将非常靠近这一原理，将蛋白单体带上一种距离敏感的信号，使得当两个单体距离较远时不发出信号，仅当其足够靠近时才能发出信号，那么这种信号就可以用来指示二聚体的形成情况。具体来讲，是将海肾荧光素酶(Rluc)基因分为N(1-229aa)，C(229-311aa)两段，分别与核心蛋白基因通过长片段接头融合，构建了两种分别表达RlucN-HBC，RlucC-HBC的重组质粒，并通过实验证明，RlucN-HBC及RlucC-HBC可形成二聚体，其发光信号可以反映二聚体的形成情况。技术实现要素：本发明的目的在于针对上述技术问题，提供一种质粒，所述质粒的核酸序列如SEQIDNo:1所示。本发明一方面提供了一种靶向HBC二聚体形成的药物筛选细胞模型，是将前述SEQIDNo:1所示的质粒酶切线性化，然后将该线性化片段转染体外培养细胞，通过筛选得到的能够表达具有Rluc荧光素酶活性的产物的细胞系。在上述技术方案中，所述体外培养细胞为HEK293细胞。在上述技术方案中，所述细胞系在四环素调控下表达具有Rluc荧光素酶活性的产物。本发明的另一方面提供了一种前述的靶向HBC二聚体形成的药物筛选细胞模型的构建方法，是将如SEQIDNo:1所示的质粒酶切线性化，然后将该线性化片段转染体外培养细胞，筛选出能够表达具有Rluc荧光素酶活性的产物的细胞系，即得。在上述细胞模型的构建方法中，所述体外培养细胞为HEK293细胞。在上述细胞模型的构建方法中，筛选出的细胞系是在四环素调控下表达具有Rluc荧光素酶活性的产物。本发明的另一方面提供了一种前述的靶向HBC二聚体形成的药物筛选细胞模型在筛选抑制HBC二聚体形成的化合物中的应用。本发明利用了分裂的海肾荧光素酶。海肾荧光素酶(Rluc)是一种从海洋动物海肾中分离到的蛋白质分子，能催化腔肠荧光素发生化学反应，从而发出绿色荧光。Rluc全长311个氨基酸，重组表达的Rluc常用作报告基因，广泛用于生物医学研究。前人研究证明，将Rluc从第229位氨基酸分成N、C两段以后，各自将失去催化活性，但若通过某种手段将两段复合后，则能部分恢复其酶活性。利用这一特性，这种分裂的Rluc可被用来指示蛋白分子间的相互作用。申请人在之前的专利申请中将海肾荧光素酶(Rluc)基因分为N(1-229aa)，C(229-311aa)两段，分别与核心蛋白基因通过长片段接头融合，构建了两种分别表达RlucN-HBC，RlucC-HBC的重组质粒。实验证明，RlucN-HBC及RlucC-HBC可形成二聚体，其发光信号可以反映二聚体的形成情况。在本发明中，我们以前期构建的质粒RlucN-HBC和RlucC-HBC为基础，对其做进一步构建和改造，使RlucN-HBC及RlucC-HBC在同一个载体上实现四环素调控下的表达，然后，利用该载体转染HEK293细胞，筛选并鉴定出稳定表达细胞NCTP6，该细胞株即可作为靶向HBC二聚体形成的药物筛选细胞模型。本发明的有益效果是：本发明得到的质粒NCTPuro可以成功应用于药物筛选模型细胞系NCTP6的构建当中，构建的药物筛选模型细胞系NCTP6经实验证明能够在四环素调控下表达具有Rluc荧光素酶活性的产物，成功筛选出了能够抑制HBC二聚体形成的化合物。利用该细胞模型可以方便快捷地对影响HBC二聚体形成的化合物进行初筛，筛选到的化合物若能够阻止HBC二聚体的形成，则亦可能有效地阻止乙肝病毒的复制，那么可以据此开发阻止HBC二聚体形成的药物来治疗乙肝，在乙肝病毒相关科学研究以及抗病毒药物筛选方面有非常好的应用价值。附图说明图1是质粒pTRE-RN-RC构建流程示意图。图2是质粒NCTPuro构建流程示意图。图3是稳定细胞系NCTP6的构建流程示意图。图4是筛选细胞系NCTP6过程中细胞克隆的Rluc荧光素酶活性表达检测结果。图5是四环素撤除后细胞克隆中Rluc活性随时间变化结果图。图6是用本发明细胞模型进行化合物筛选的流程示意图。图7是用本发明细胞模型进行化合物初步筛选的部分结果图。具体实施方式本发明实施例中所用试剂来源如下：2×PrimeSTARHSMix：Takara公司，日本胶回收试剂盒、基因组DNA提取试剂盒：QIAGEN公司，德国质粒模板PTRE-HBV1.1由美国印第安纳大学医学院郭海涛教授赠送质粒模板pXPR由美国麻省理工大学张峰博士实验室构建，从Addgene购买大肠杆菌JM109、Rellina荧光素酶检测试剂盒、Glomax荧光素酶检测仪：Promega公司，美国BsmBI、Tangobuffer、DTT、Puromycin：Thermoscientific公司，美国DMEM：GIBICO公司，美国T7ligase：Enzymatics公司，美国ATP、NotI内切酶：NewEnglandBiolabs公司，美国X-tremeGENETMHPDNA转染试剂：Roche公司，德国HEK293细胞：美国模式菌种收集中心HepAD38细胞：由四川大学华西医院唐红教授赠送本发明实施例中所用扩增引物序列如下：实施例一、构建质粒NCTPuro本申请中使用到的质粒RlucN-HBC和RlucC-HBC和申请人在前期的专利申请(公开号CN106188310A，申请号CN201610564291.6)中构建的质粒RlucN-HBC和RlucC-HBC相同。质粒NCTPuro需实现以下功能：(1)能表达RlucN-HBC和RlucC-HBC；(2)RlucN-HBC和RlucC-HBC的表达都受四环素控制，为了实现这一点，RlucN-HBC和RlucC-HBC表达框需置于四环素响应元件+MiniCMV启动子下游，且需表达四环素控制的转录激活蛋白(tTA)；(3)需带有方便稳定转染细胞筛选的抗puromycin抗性基因。该质粒的构建步骤如下：一、构建质粒PTRE-RlucN构建质粒PTRE-RlucN，将驱动RlucN-HBC表达的启动子CMV替换为TRE-miniCMV启动子，按照如下步骤操作：1、以质粒PTRE-HBV1.1为模板，进行PCR扩增，反应体系为：质粒PTRE-HBV1.110ng，引物Fptregg3(10μM)及RBsmb1vect(10μM)各1μl，2XPrimeSTARHSMix25μl，灭菌超纯水补齐体积至50μl。反应条件：95℃预变性3min；94℃15s，58℃15s，72℃20s，35个循环。用胶回收试剂盒回收扩增片段，将该回收片段命名为frag1。2、第二个片段的扩增，以RlucN-HBC为模板进行PCR。反应体系为：质粒RlucN-HBC10ng，引物FrlucNGG(10μM)及Ramp(10μM)各1μl，2XPrimeSTARHSMix25μl，灭菌超纯水补齐体积至50μl。反应条件：95℃预变性3min；94℃15s，55℃15s，72℃1min30s，35个循环。用胶回收试剂盒回收扩增片段，将该回收片段命名为frag2。3、第三个片段的扩增，以RlucN-HBC为模板进行PCR。反应体系为：模板RlucN-HBC10ng，Famp(10μM)及RCMVGG(10μM)各1μl，2XPrimeSTARHSMix25μl，灭菌超纯水补齐体积至50μl。反应条件：95℃预变性3min；94℃15s，55℃15s，72℃1min，35个循环。用胶回收试剂盒回收扩增片段，将该回收片段命名为frag3。4、将以上得到的三个片段frag1、frag2和frag3做Goldengate连接反应，反应体系为：BsmBI酶0.75μlTangobuffer1μlDTT1μlT7ligase0.25μlATP1μlfrag12μl(40ng)frag22μl(100ng)frag32μl(80ng)总体积10μl反应条件：37℃5min，20℃5min，循环25次；80℃20min灭活反应。将Goldengate产物转化JM109感受态细菌，涂板，克隆初筛，测序鉴定，正确的克隆命名为质粒PTRE-RlucN，其结构如图1中所示。二、构建质粒PTRE-RlucC构建质粒PTRE-RlucC，将驱动RlucN-HBC表达的启动子CMV替换为TRE-miniCMV启动子。构建步骤与上述PTRE-RlucN的构建步骤类似，使用的frag1和frag3即是PTRE-RlucN构建过程中的frag1和frag3。另一个片段frag4的扩增是以RlucC-HBC为模板进行PCR，反应体系为：模板RlucC-HBC10ng，FrlucCGG(10μM)及RCMVGG(10μM)各1μl，2XPrimeSTARHSMix25μl，灭菌超纯水补齐体积至50μl。反应条件：95℃预变性3min；94℃15s，55℃15s，72℃1min30s，35个循环。用胶回收试剂盒回收扩增片段，将该回收片段命名为frag4。将以上得到的三个片段frag1、frag4和frag3做Goldengate连接反应，反应体系为：BsmBI酶0.75μlTangobuffer1μlDTT1μlT7ligase0.25μlATP1μlfrag140ngfrag490ngfrag380ngddH2O补齐至10μl总体积10μl反应条件：37℃5min，20℃5min，循环25次；80℃20min灭活反应。将Goldengate产物转化JM109感受态细菌，涂板，克隆初筛，测序鉴定，正确的克隆命名为质粒PTRE-RlucC，其结构如图1中所示。三、质粒PTRE-RN-RC构建质粒PTRE-RN-RC是以前述两个质粒PTRE-RlucN和PTRE-RlucC为基础构建的，目的是将RlucN和RlucC的表达片段克隆到同一个质粒上。首先以PTRE-RlucC为模板，用引物FCMV55和RSV40GG3扩增片段frag5，然后以PTRE-RlucN为模板，用引物Fpch9gg和Ramp扩增片段frag6，以PTRE-RlucN为模板，用引物Rpch9gg和Famp扩增片段frag7，再将片段frag5，frag6和frag7做Goldengate连接反应，最终测序鉴定正确的质粒命名为PTRE-RN-RC(其构建过程和其结构如图1中所示)。片段frag5的扩增体系为：模板PTRE-RlucC10ng，FCMV55(10μM)及RSV40GG3(10μM)各1μl，2XPrimeSTARHSMix25μl，灭菌超纯水补齐体积至50μl。反应条件：95℃预变性3min；94℃15s，55℃15s，72℃1min，35个循环。片段frag6的扩增体系为：模板PTRE-RlucN10ng，Fpch9gg(10μM)及Ramp(10μM)各1μl，2XPrimeSTARHSMix25μl，灭菌超纯水补齐体积至50μl。反应条件：95℃预变性3min；94℃15s，55℃15s，72℃1min，35个循环。片段frag7的扩增体系为：模板PTRE-RlucN10ng，Rpch9gg(10μM)及Famp(10μM)各1μl，2XPrimeSTARHSMix25μl，灭菌超纯水补齐体积至50μl。反应条件：95℃预变性3min；94℃15s，55℃15s，72℃1min30s，35个循环。Goldengate连接反应的反应体系为：BsmBI酶0.75μlTangobuffer1μlDTT1μlT7ligase0.25μlATP1μlfrag560ngfrag660ngfrag7100ngddH2O补齐至10μl总体积10μl反应条件：37℃5min，20℃5min，循环25次；80℃20min灭活反应。四、质粒PCH9-tTA构建PCH9-tTA是能表达四环素调控转录激活因子的质粒，我们从HepAD38细胞基因组中扩增tTA基因，并将其克隆PCH9上。按照如下步骤操作：1、用QIAGEN基因组DNA提取试剂盒提取HepAD38细胞的基因组DNA，然后以其为模板扩增tTA基因。反应体系为：HepAD38细胞基因组DNA500ng，FTta(10μM)及RTta(10μM)各1μl，2XPrimeSTARHSMix25μl，灭菌超纯水补齐体积至50μl。反应条件：95℃预变性5min；94℃30s，55℃15s，72℃1min，35个循环。用胶回收试剂盒回收扩增片段，将该回收片段命名为frag8。2、以RlucN-HBC为模板，扩增PCH9的质粒骨架片段：反应体系为：模板RlucN-HBC10ng，FSV40GG2(10μM)及RBsmb1vect(10μM)各1μl，2XPrimeSTARHSMix25μl，灭菌超纯水补齐体积至50μl。反应条件：95℃预变性3min；94℃15s，57℃15s，72℃2min，35个循环。用胶回收试剂盒回收扩增片段，将该回收片段命名为frag9。3、将以上得到的两个片段frag8和frag9做Goldengate连接反应，反应体系为：BsmBI酶0.75μlTangobuffer1μlDTT1μlT7ligase0.25μlATP1μlfrag850ngfrag9120ngddH2O补齐至10μl总体积10μl反应条件：37℃5min，20℃5min，循环25次。80℃20min灭活反应。Goldengate产物转化JM109感受态细菌，涂板，克隆初筛，测序鉴定，正确的克隆命名为质粒PCH9-tTA，其结构如图2中所示。五、质粒PCH9-puro构建以质粒pXPR为模板，扩增puromycin抗性基因片段。反应体系为：模板pXPR10ng，FpuroGG(10μM)及RpuroGG(10μM)各1μl，2XPrimeSTARHSMix25μl，灭菌超纯水补齐体积至50μl。反应条件：95℃预变性3min；94℃15s，57℃15s，72℃40s，35个循环。用胶回收试剂盒回收扩增片段，将该回收片段命名为frag10。将frag10与前述片段frag9做Goldengate连接反应(反应体系与反应条件参照frag8和frag9的Goldengate连接反应)，转化所得克隆经测序验证后命名为PCH9-puro。六、质粒tTA-puro构建为了将tTA和puro抗性基因表达片段克隆到同一个质粒上，首先以PCH9-puro为模板，用引物FCMV55和RSV40GG3扩增片段frag11，然后以PCH9-tTA为模板，用引物Fpch9gg和Ramp扩增片段frag12，以PCH9-tTA为模板，用引物Rpch9gg和Famp扩增片段frag13，再将片段frag11，frag12和frag13做Goldengate连接反应，最终测序鉴定正确的质粒命名为tTA-puro(其结构如图2中所示)。PCR反应的扩增体系和反应条件、以及Goldengate反应体系和条件参照“三、质粒PTRE-RN-RC构建”中的反应。七、质粒NCTPuro构建首先，以tTA-puro为模板，用引物FCMVup(带有NotI酶切位点)及Ramp扩增得到片段frag14，然后以前述构建的质粒PTRE-RN-RC为模板，用引物Famp及Rpch9GG2扩增片段frag15，再将片段frag14和frag15做Goldengate连接反应，最终测序鉴定正确的质粒命名为NCTPuro(其构建过程和其结构如图2中所示)，其核酸序列如SEQIDNo:1所示。frag14扩增体系：模板PTRE-RN-RC10ng，FCMVup(10μM)及Ramp(10μM)各1μl，2XPrimeSTARHSMix25μl，灭菌超纯水补齐体积至50μl。反应条件：95℃预变性3min；94℃15s，58℃15s，72℃2min30s，35个循环。frag15的扩增体系：模板PTRE-RN-RC10ng，Famp(10μM)及Rpch9GG2(10μM)各1μl，2XPrimeSTARHSMix25μl，灭菌超纯水补齐体积至50μl。反应条件同frag14的PCR反应条件。Goldengate反应体系和条件参照“四、质粒PCH9-tTA构建”中的反应。实施例二、四环素调控的RlucN-HBC与RlucC-HBC共表达稳定细胞系构建为了方便后续药物筛选，需构建RlucN-HBC与RlucC-HBC共表达的稳定细胞系(该方法步骤流程如图3所示)，按照如下步骤操作：1、首先用NotI内切酶将20μg实施例一中构建的NCTPuro质粒酶切线性化，然后将该线性化片段转染HEK293细胞(6cm培养皿)，48小时后，开始用2μg/mlPuromycin筛选，筛选3天后，将存活细胞用胰酶消化，以有限稀释法稀释接种至96孔板，继续筛选约2周，待细胞克隆长大后鉴定。2、将最终获得的20个单克隆细胞进行鉴定，分别将这些细胞接种到96孔板，并分别用含有和不含有2μg/ml四环素的培养基培养48小时后，将细胞裂解，检测裂解液中的Rluc荧光素酶活性。如图4所示，在20个细胞克隆中，6号克隆和8号克隆在用无四环素培养基培养时，与用含四环素的培养基相比，Rluc荧光素酶活性显著上升(>100倍)，其中6号克隆这种差异更显著。这证明6号和8号克隆可以表达具有Rluc荧光素酶活性的产物，并且其表达受到四环素调控，是满足我们需求的细胞克隆。我们进一步检测了四环素撤除后，6号隆中的Rluc活性随时间变化情况，如图5所示，随着四环素撤除时间延长，Rluc活性逐渐升高，4天后信号值可达到约400,000，而未撤除四环素的细胞，荧光素酶信号则一直处于背景水平。最终选择6号克隆作为后续药物筛选的细胞，将其命名为细胞系NCTP6。实施例三、利用NCTP6进行初步药物筛选在获得稳定细胞系NCTP6以后，即可用于药物筛选。我们利用该细胞，筛选了一个含有218种天然化合物的库，筛选流程如下：复苏NCTP6细胞，用含2μg/ml四环素的DMEM培养基培养于10cm培养皿中。在接种前一天，将培养基更换为无四环素DMEM培养基。第二天上午，将细胞以约90％汇合度接种于96孔板。细胞接种后约6小时待细胞贴壁，将待测化合物分别加入96孔板中，终浓度为20μM，每种化合物做3个复孔。加药后约48小时，吸去培养基，每孔加入细胞裂解液，室温摇动孵育20min，然后取裂解液用荧光素酶检测仪进行检测(操作流程如图6所示)。在筛选的218种天然化合物中，能使Rluc活性降低3倍或以上的化合物共有32种(图7a、7b显示了部分筛选结果)，除去那些能引起明显细胞死亡的，有7种化合物可以作为下一步深入研究的对象。能使Rluc活性升高2倍以上的化合物有2种，它们也可以作为候选化合物进行更深入研究。这些筛选结果表明，不同化合物对NCTP6细胞中的Rluc活性有不同影响，该细胞模型可以方便快捷地对影响HBC二聚体形成的化合物进行初筛。序列表<110>重庆医科大学<120>靶向HBC二聚体形成的药物筛选细胞模型及其构建和应用<130>1<160>19<210>1<211>11147<212>DNA<213>人工序列<223>质粒NCTPuro的核酸序列<400>1cgtttaagaaaccattattatcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgaggcc1ctttcgtcttcactcgaatatctgcaggcgtatcacgaggccctttcgtcttcactcgag120tttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcag180tgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaa240gtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagctcggtacccgg300gtcgaggtaggcgtgtacggtgggaggcctatataagcgtcgagcaccagcacctgcaac360tttttcacctctgcctaatcatctcttgttcatgtcctactgttcaagcctccaagctgt420gccttgggtggctttggggcatgacttcgaaagtttatgatccagaacaaaggaaacgga480tgataactggtccgcagtggtgggccagatgtaaacaaatgaatgttcttgattcattta540ttaattattatgattcagaaaaacatgcagaaaatgctgttatttttttacatggtaacg600cggcctcttcttatttatggcgacatgttgtgccacatattgagccagtagcgcggtgta660ttataccagaccttattggtatgggcaaatcaggcaaatctggtaatggttcttataggt720tacttgatcattacaaatatcttactgcatggtttgaacttcttaatttaccaaagaaga780tcatttttgtcggccatgattggggtgcttgtttggcatttcattatagctatgagcatc840aagataagatcaaagcaatagttcacgctgaaagtgtagtagatgtgattgaatcatggg900atgaatggcctgatattgaagaagatattgcgttgatcaaatctgaagaaggagaaaaaa960tggttttggagaataacttcttcgtggaaaccatgttgccatcaaaaatcatgagaaagt1020tagaaccagaagaatttgcagcatatcttgaaccattcaaagagaaaggtgaagttcgtc1080gtccaacattatcatggcctcgtgaaatcccgttagtaaaaggtggttcgtctggatcag1140gcggtggcggttcaggaggtggtggctcaggcggaggaggttccggtggcggcggcagtg1200gtggtggaggctctggtggtggaggctctggaggcgg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