一种检测靶向CD33的CART细胞中CAR表达的荧光定量试剂盒的制作方法

本发明涉及细胞免疫治疗领域，更特别地，涉及一种一种检测靶向cd33的cart细胞中car表达的荧光定量试剂盒以及检测方法。

背景技术：

cd33是一个白细胞分化抗原,具有364个氨基酸的跨膜糖蛋白，与唾液酸粘附素家族的成员具有序列同源性，该家族包括髓鞘相关糖蛋白和cd22，以及唾液酸粘附素本身。它可被骨髓祖细胞、单核细胞、巨噬细胞、粒细胞前体等细胞表达。尽管cd33的特殊功能还不清楚，但其与唾液酸粘附素的同源性提示其在凝集素家族的碳水化合物结合特性中的作用，这种作用随后被证实。临床研究显示，cd33可在超过80％的急性骨髓性白血病(aml)病例中呈阳性表达。由于cd33的选择性表达，结合细胞毒类药物的免疫偶联物，能特异识别和结合cd33的单克隆抗体，已经被建议用于选择性靶向aml细胞。

细胞免疫治疗是一种正在兴起的治疗肿瘤或恶性疾病的方法，其通过分子生物学技术构建嵌合抗原受体(chimericantigenreceptor，car)的表达载体，并将该表达载体导入到从人体分离的有核细胞中，诱导其表达car并且分化成t细胞后，将其回输至人体。表达car的t细胞能够特异性识别靶细胞，并对其进行杀伤。

在这种治疗方法中，car的作用至关重要。嵌合抗原受体包括单链抗体结构域、跨膜结构域、胞内信号结构域。其中，单链抗体结构域将t细胞靶向目标细胞，胞内信号结构域释放胞内信号，启动t细胞的杀伤活性。

此外，在将car表达载体导入t细胞中后，需要高效和准确的方法来检测所得到的cart细胞中car是否被有效表达。

荧光定量pcr是一种精确检测目的基因表达情况的技术。根据化学原理的不同，荧光定量pcr可分为探针法和染料法。其中taqman荧光定量技术以taqman荧光探针为基础。taqman荧光探针，也称为水解探针，为一寡核苷酸，两端分别标记一个荧光发射基团和一个荧光淬灭基团。探针完整时，发射基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；pcr扩增时，taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使荧光发射基团和荧光淬灭基团分离，荧光监测系统就可以接收到荧光信号。具体地，当探针与靶序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭基团接近而被淬灭；在进行延伸反应时，taq聚合酶的5’-3’外切酶活性将探针切断，使得荧光基团与淬灭基团分离，发出荧光。一分子产物生成伴随一分子荧光信号产生，随着扩增产物的增加，荧光增强。

taqman水解探针由于其特异性较高而广范地应用于荧光定量pcr实验。一般情况下，为了保证理想的扩增效率(90-110％)，要求荧光定量pcr实验的扩增产物长度不宜超过400bp，更理想的最好能在50-150bp内，扩增片段越短，有效的扩增反应就越容易获得。由于taqman探针的苛刻要求，导致探针和扩增引物的位置都不容易选取。此外，还需考虑到在car表达载体构建过程中或表达载体在cart细胞内的复制过程中发生突变的情况，如果突变位置正好出现在探针或扩增引物的范围内，则有可能因为错配而影响检测结果。

技术实现要素：

为解决以上问题，本发明提供了一种检测靶向cd33的cart细胞中car表达的荧光定量试剂盒，所述cart细胞中转染了带有编码cd33scfv的car核酸片段的表达载体质粒，并且所述编码car核酸的序列如seqidno:7所示，所述荧光定量试剂盒包括第一引物探针组和第二引物探针组，所述第一引物探针组中包括seqidno:1所示的探针1以及seqidno:2所示的引物1f和seqidno:3所示的引物1r，所述第二引物探针组中包括seqidno:4所示的探针2以及seqidno:5所示的引物2f和seqidno:6所示的引物2r，所述探针1和探针2都为taqman探针，所述cart细胞中转染了带有编码cd33scfv的car核酸片段的表达载体质粒，并且所述编码car核酸的序列如seqidno:7所示。

优选地，所述探针1和探针2的5’端均带有荧光基团5-fam，3’端均带有淬灭基团6-tamra。

优选地，所述荧光定量试剂盒还包括标准品、阳性对照样品和阴性对照样品，其中所述标准品为包含定量所述表达载体质粒的样品，所述阳性对照样品为含有seqidno:7所示序列的dna样品，所述阴性对照样品为不含seqidno:7所示序列的dna样品。

本发明还提供了一种检测靶向cd33的cart细胞中car表达的方法，其包括以下步骤：

s1：从cart细胞提取rna并反转录成cdna；

s2：将所述cdna分别与所述第一引物探针组和第二引物探针组加上荧光定量pcr试剂构成第一荧光定量pcr体系和第二荧光定量pcr反应体系；

s3：进行荧光定量pcr反应，并通过所述荧光定量pcr反应的数据确定cart细胞中的car表达量。

优选地，在s2前进行步骤s4：使用梯度稀释的所述标准品制作标准曲线。

优选地，在s2中还分别使用所述阳性对照和阴性对照样品配制了阳性对照pcr体系和阴性对照pcr体系，并且所述阳性对照pcr体系和阴性对照pcr体系在s3中与所述第一荧光定量pcr体系和第二荧光定量pcr反应体系在同一荧光定量pcr仪中进行荧光定量pcr反应。

通过本发明的试剂盒及检测方法，可精确检测car在cart细胞中的表达情况，并根据检测结果选择car表达量最高的cart细胞回输至人体内，以达到最佳的抗肿瘤或恶性疾病的治疗效果。

附图说明

图1为实施例中编码cd33嵌合抗原受体的dna片段的示意图；

图2为荧光定量标准曲线；

图3为经检测得到的样品1-4的模板拷贝数；

图4为样品1-4的cart细胞对cd33阳性细胞的杀伤活性；

图5为样品1-4的cart细胞对不表达cd33的细胞的杀伤活性；。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

1.cd33scfv嵌合抗原受体表达质粒的构建

通过人工合成seqidno:7所示的长度为1605bp的dna片段，其中，第1-801位的核苷酸编码cd33scfv，第802-936位的核苷酸编码cd8铰链区，第937-1140位的核苷酸编码cd28，第1141-1266位的核苷酸编码41bb，第1267-1605位的核苷酸编码cd3。后面三个区域构成胞内信号区(图1)。

将上述dna片段插入慢病毒表达载体plvx-ires-puro的cmv启动子下游，得到cd33scfv嵌合抗原受体表达质粒。

2.cd33scfv嵌合抗原受体表达质粒转染t细胞

1)慢病毒的包装制备

将cd33scfv嵌合抗原受体表达质粒和辅助质粒pspax2、pmd2.g以4:3:1的比例用lipo2000转染试剂(invitroge)转染，具体方法见lipo2000转染试剂说明书。转染48小时后，将含有病毒的细胞培养上清吸入ep管中，4℃2000g离心10min，转移上清至新ep管中，4.5μm滤器过滤后-80℃保存。

2)t细胞的制备

取10ml健康人的新鲜血液，用淋巴细胞分离液(mediatech)分离外周血单核细胞，具体方法见说明书。用含有300iu/ml的il-2、50ng/ml的okt-3和5％人ab血清(invitrogen)的aim-v培养基(invitrogen)诱导培养48h，得到t细胞。

3)慢病毒感染t细胞及感染后t细胞的扩增培养

从-80℃取出2ml病毒液，加入终浓度为8μg/ml的聚凝胺(购自sigma公司)，用该病毒液重悬1×10⁶个上述诱导培养的t细胞。将细胞悬液加入24孔板的1个孔中，1000g，32℃，离心1h。37℃，5％co2培养箱内培养8h后，1000g，32℃，再次离心1h。吸弃1.4ml培养上清，加入1.4ml新鲜的含有300iu/ml的il-2、50ng/ml的okt-3和5％人ab血清的aim-v培养基，继续培养。每2-3天检测一次细胞浓度，当细胞浓度达到2×10⁶个/ml时，1000g，32℃，离心1h。吸取1ml细胞悬液，加入另一个孔中，分别向两个孔中加入1ml新鲜的含有300iu/ml的il-2和5％人ab血清的aim-v培养基，继续扩大培养。如此反复，直至细胞扩增至足够的用量。

3.检测cart细胞中car的表达情况

1)使用的探针和扩增引物

在检测过程中使用两组探针和引物分别进行检测。

探针引物组1包括以下成分：

探针1：5’-cgccaccagagccaccgccacc-3’(seqidno:1)；

引物1f：5’-ggaggcaccaaactggaaatcaa-3’(seqidno:2)；

引物1r：5’-gttgcacctgtgagccacc-3’(seqidno:3)；

探针引物组2：包括以下成分：

探针2：5’-cagcctgacatctgaggactctgcggtct-3’(seqidno:4)；

引物2f：5’-tcctccaccacagcctaca-3’(seqidno:5)；

引物2r：5’-ccagacatcgaagtaccgtagac-3’(seqidno:6)；

探针1和探针2的5’端均带有荧光基团5-fam，3’端均带有淬灭基团6-tamra。

2)标准曲线的制作

荧光定量pcr检测试剂于冰上融化。在无菌操作台中依次取荧光定量pcr检测试剂24μl，加入标准品或阴性对照dna1μl于pcr反应管中充分混合，每个浓度的标准品进行三次重复。操作中避免直射光照射。把荧光定量pcr反应管置于荧光定量pcr仪上，设置反应条件为：95℃1min；95℃10sec，57℃15sec，72℃35sec，共40个循环；95℃15sec，60℃1min，95℃30sec，60℃15sec。对图2所示的检测标准曲线进行分析可见，模板的5个稀释点均在同一条直线上，表明当基因拷贝数在1.0×10⁸-1.0×10⁴范围内时，检测域值与拷贝数之间均呈良好的线性关系；回归分析显示，r²＝0.9923；可见本发明设计的引物及荧光探针的特异且工作性能良好。

3)cart细胞中car表达量的检测

从上述得到多个cart细胞样品中取出来自四个不同的孔的cart细胞(样品1-4)，采用trizol法提取总rna，用superscripttmpreamplificationsystemforfirststrandcdnasynthesis试剂盒(invitrogen)做反转录，制备cdna。将四种来源的cdna、阳性对照样品、阴性对照样品分别与第一探针引物组和第二探针引物组以及荧光定量pcr试剂混合分别得到各样品的荧光定量pcr反应体系，每个样品三个重复。

进行以下pcr反应：95℃1min；95℃10sec，57℃15sec，72℃35sec，共40个循环；95℃15sec，60℃1min，95℃30sec，60℃15sec。反应结束后，得到反应产物。

荧光pcr仪采集荧光信号，经计算机软件生成阴性对照点和阳性对照点；阴性对照无ct值并且无扩增曲线，阳性对照点位于标准曲线上，并且其ct值＜32，说明该次反应数据是有效的。

通过计算，样品1-4的cdna起始模板拷贝数如图3所示。

4)样品1-4的cart细胞对cd33阳性的恶性细胞的特异性杀伤活性

分别取5×10⁴个aml细胞(高表达cd33)和人成纤维细胞bj接种于96孔板，过夜培养后，分别向两种细胞培养孔中按效应细胞(e)：靶细胞(t)＝10:1和3:1的比例加入car-t细胞、对照病毒修饰的t细胞(gfp-t)和未加修饰的t细胞(t)。孵育5h后，按照ldh细胞毒性分析试剂盒(caymanchemical)说明书进行操作，检测cart细胞对aml细胞的特异杀伤活性。结果显示cart细胞组与gfp-t组和t细胞组相比，在效靶比为10:1和3:1的情况下，样品3和4对高表达cd33的aml细胞都具有更强的杀伤作用，而样品2的杀伤活性显著更弱(图4)；对不表达cd33的人成纤维细胞bj的杀伤作用差异不大(图5)。因此cart细胞对高表达cd33的aml细胞具有特异杀伤活性。

由此可见，car表达量越高的cart细胞对cd33阳性细胞的杀伤性越大，可通过该方法筛选最高效地cart细胞回输至体内以达到最好的抗肿瘤效果。

序列表

<110>武汉波睿达生物科技有限公司

<120>一种检测靶向cd33的cart细胞中car表达的荧光定量试剂盒

<130>1

<160>7

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

cgccaccagagccaccgccacc22

<210>2

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

ggaggcaccaaactggaaatcaa23

<210>3

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

gttgcacctgtgagccacc19

<210>4

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

cagcctgacatctgaggactctgcggtct29

<210>5

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

tcctccaccacagcctaca19

<210>6

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

ccagacatcgaagtaccgtagac23

<210>7

<211>1605

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccagg60

ccgaacattatgctgacacagtcgccatcatctctggctgtgtctgcaggagaaaaggtc120

actatgagctgtaagtccagtcaaagtgtttttttcagttcaagtcagaagaactacttg180

gcctggtaccaacagataccagggcagtctcctaaacttctgatctactgggcatccact240

agggaatctggtgtccctgatcgcttcacaggcagtggatctgggacagattttactctt300

accatcagcagtgtacaatctgaagacctggcaatttattactgtcatcaatacctctcc360

tcgcggacgttcggtggaggcaccaaactggaaatcaaacgaggtggcggtggctctggt420

ggcggtggctccggtggcggtggctcacaggtgcaactgcagcagcctggggctgaggtg480

gtgaagcctggggcctcagtgaagatgtcctgcaaggcttctggctacacatttaccagt540

tactatatacactggataaagcagacacctggacagggcctggaatgggttggagttatt600

tatccaggaaatgatgatatttcctacaatcagaagttcaaaggcaaggccacattgact660

gcagacaaatcctccaccacagcctacatgcaactcagcagcctgacatctgaggactct720

gcggtctattactgtgcaagagaggttcgtctacggtacttcgatgtctggggcgcaggg780

accacggtcaccgtctcctcaaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgccc840

accatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggc900

gcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatttttgggtgctggtggtggttggt960

ggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgagg1020

agtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccggg1080

cccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctcc1140

aaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaa1200

actactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgt1260

gaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaac1320

cagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagaga1380

cgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctg1440

tacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggc1500

gagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaag1560

gacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaa1605