藻类培养中腔轮虫的快速定量检测qPCR方法与流程

文档序号:12412814阅读:来源:国知局

技术特征:

1.腔轮虫CoI基因在作为藻类培养中腔轮虫的快速定量检测qPCR方法的分子标记中的应用。

2.一种DNA分子标记,包含腔轮虫CoI基因的三段特异性区域序列,其序列分别如SEQ ID No.1-3所示。

3.一组引物组,其可分别特异性扩增权利要求2所述的分子标记。

4.根据权利要求3所述的引物组,包含三对引物,分别用于特异性扩增序列SEQ ID No.1-3,各自的上下游引物序列如下:

(1)CoI-1F:5’-TAATGTTAGGGGTTGCTGAT-3’;

CoI-1R:5’-ATGAAGTTACTAATAAAATAGCTGT-3’;

(2)CoI-2F:5’-TTATCTTCTATTCTGGATGCTG-3’;

CoI-2R:5’-TTGGTATAATACAGGATTGCC-3’;

(3)CoI-3F:5’-GTTCTCGTACAACAAAAATGAT-3’;

CoI-3R:5’-TTGGTATAATACAGGATTGCC-3’。

5.权利要求2所述分子标记或权利要求3或4所述引物组在藻类培养中腔轮虫的快速定量检测qPCR方法中的应用。

6.一种藻类培养中腔轮虫的快速定量检测qPCR方法,其特征在于,采用权利要求3或4所述的特异性引物组,对待测样品的基因组DNA进行荧光定量PCR检测。

7.根据权利要求6所述的快速定量检测qPCR方法,其特征在于,还包括步骤:采用所述的特异性引物组,将包含目的扩增片段的基因克隆到质粒PGEM-T中,构建的重组质粒PGEMT-CoI作为检测腔轮虫浓度的定量标准品。

8.根据权利要求6所述的快速定量检测qPCR方法,其特征在于,所述特异性引物:上游引物和下游引物的浓度均为10μmol/L,反应终浓度为0.25μmol/L。

9.根据权利要求6所述的快速定量检测qPCR方法,其特征在于,所述荧光定量PCR采用的荧光染料为SYBR Green染料,荧光检测波长为470-514nm。

10.根据权利要求6所述的快速定量检测qPCR方法,其特征在于,所述荧光定量PCR的反应体系为:20μL反应体系中包含:2×的LightCycler 480 SYBR Green Ⅰ Master 10μL,10μmol/L的上游引物0.5μL,10μmol/L的下游引物0.5μL,DNA模板1μL,加水至总体积20μL。

11.根据权利要求6所述的快速定量检测qPCR方法,其特征在于,所述荧光定量PCR的反应程序为:95℃5min,1个循环;95℃10s、56℃20s、72℃30s,40个循环。

12.根据权利要求6-11所述的快速定量检测qPCR方法,其特征在于,以结果的判断方法如下:

(1)阳性对照的Ct值应小于36.0,阴性对照的Ct值应大于39.0。阳性模板为质粒定量标准品PGEMT-CoI-1、PGEMT-CoI-2和PGEMT-CoI-3,阴性模板为无菌双蒸水;

(2)若Ct值小于36.0,且呈现典型的扩增曲线,则判定为阳性结果,表明检测样品中含有腔轮虫;

(3)若Ct值大于39.0或无扩增信号,则判定为阴性结果,表明检测样品中无腔轮虫;

(4)若Ct值在36.0~39.0之间,则视为可疑结果,样品需重复检验一次;

若结果仍在此范围内,则判定为阴性结果;

结果呈阳性的样品,根据其Ct值以及建立的定量标准曲线计算样品内的腔轮虫含量;

计算公式如下:

样品含腔轮虫的只数(cells/ml)=conc/N,其中N代表每只腔轮虫中CoI基因的拷贝数。

13.一种qPCR试剂盒,其包括权利要求3或4所述的特异性引物组。

14.根据权利要求13所述的试剂盒,其特征在于:包括检测试剂和基因组DNA提取试剂。

15.根据权利要求14所述的试剂盒,其特征在于:所述检测试剂包括荧光染料、权利要求3或4所述的特异性引物组、阳性标准品。

16.根据权利要求14所述的试剂盒,其特征在于:所述基因组DNA提取试剂包括Roche的High Pure Template Preparation Kit试剂盒。

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