一种毒素Tx4(6‑1)无标签重组蛋白的生产方法与流程

本发明涉及利用生物技术领域，具体涉及一种蜘蜘神经毒素Tx4(6-1)的优化编码基因与重组蛋白的生产。

背景技术：

昆虫神经毒素是一类只作用于昆虫神经系统，有毒杀作用的多肽类神经毒素，主要来自于蝎，其次来自蜘蛛。这类对昆虫有专一毒杀作用的毒素的作用位点是各种离子通道，具有高效昆虫专一性的神经毒素主要是作用于钠离子通道的长链神经毒素，这类长链神经毒素一般由60-70个氨基酸组成，有2-4对链内二硫键。不同种属来源的神经毒素在氨基酸的组成上没有明显的保守性，而同种来源神经毒素在一级结构上具有很高的保守性。蜘蛛神经毒素基因TX4 (6-1)是一种源自巴西流浪蜘蛛”(Phoneutria nigriventer)的昆虫专一性神经毒素，对农业害虫具有很可的毒杀活性。昆虫神经毒素具有控制农业害虫的重要潜在价值，但天然昆虫神经毒素在毒腺中的含量低且提取困难的，并且往往只能得到非常少量的纯品，这就给我们进一步研究这些毒素的特性带来了很大的困难。因此，通过分离少量昆虫毒素，测定其氨基酸组成，再得到其成熟基因全长，通过体外大量表达，成为研究这些毒素的一条重要途径。

现有技术中将昆虫神经毒素构建表达载体，然后转化到E. coli BL21(DE3)进行表达，但得到的都是无活性的包涵体，通过在体外合适的条件下进行溶解、变性、复性和纯化，从每升培养基仅能得到微量的可溶性蛋白质，生产量低；也存在将构建的表达载体在酵母中表达的方法，但其表达量低且分离纯化困难。目前，还没有通过改造Tx4(6-1)的DNA序列且优化Tx4(6-1)表达纯化方法来高效生产Tx4(6-1)重组蛋白的方式，极大影响了Tx4(6-1)的抗虫特性和生物安全性的分析研究尤其影响其在抗虫中的应用，因此需开发出一种可以降低成本、实现大量生产且具有生物活性的昆虫神经毒素Tx4(6-1)的方法。

技术实现要素：

针对现有技术中的缺陷，本发明目的之一在于提供一种蜘蜘神经毒素Tx4(6-1)的编码基因及其重组蛋白的生产方法。

本发明提供基因，为编码蜘蜘神经毒素Tx4(6-1)类蛋白的基因，为序列表中序列1所示的DNA分子，其编码基因的读码框包含147个核苷酸，其中前144个核苷酸编码对应的氨基酸，后3个核苷酸为终止密码子。序列表中的序列1翻译成的蛋白包括48个氨基酸残基，为序列表中序列2所示的蛋白质分子。

所述重组载体具体为将上述基因插入表达载体中，得到表达上述蛋白的重组载体。所述重组载体具体优选为将上述基因插入表达载体pET32的BamHⅠ和HindⅢ酶切位点间，得到表达上述蛋白的重组载体。

扩增所述基因全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。上述引物对中的一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列3，所述引物对中的另一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列4，利用序列3和序列4的引物扩增的目标基因同样可以进行相关的酶切和连接操作。

本发明的第二个目的是提供一种制备蛋白的方法，包括步骤：将含有权利要求1所述的基因的重组表达载体导入宿主细胞，所述宿主细胞优选为大肠杆菌，用于构建所述重组表达载体的原始载体优选为pET32载体。

还包括纯化蛋白的步骤：将表达得到的融合蛋白用肠激酶切割，再利用截留分子量为10 kDa的透析袋在pH值为6.5~6.6的5~10 mM Tris-HCl透析缓冲液中透析，将透析后所得的透析缓冲液，利用CM阳离子柱吸附后用10~30 mM NaCl溶液漂洗，再用100~150 mM NaCl洗脱，即可得高纯度的Tx4(6-1)重组蛋白。

根据上述的制备蛋白的方法制备得到的纯化后的蛋白也属于本发明的保护范围。

制备蛋白的优选方法具体包括：

S1：优化基因、构建原核表达载体及转化：人工合成经优化的成熟蝎昆虫神经毒素Tx4(6-1)基因，并连接至表达载体pET32中，得到重组表达载体pET32/Tx4(6-1)，将重组载体pET32/Tx4(6-1)转化到大肠杆菌TOP10菌株中，再从TOP10中提取重组载体pET32/Tx4(6-1)；用热激法将重组载体pET32/Tx4(6-1)转入到宿主细胞大肠杆菌表达菌株中，用含有Amp抗性的LB平板筛选得到包含有重组载体pET32/Tx4(6-1)的大肠杆菌表达菌株转化子；

S2：可溶性Trx-Tx4(6-1)融合蛋白的表达与提取：将步骤S1所得的包含有重组载体pET32/Tx4(6-1)的大肠杆菌表达菌株转化子在37℃的LB液体抗性培养基中培养至OD₆₀₀为0.5~0.8时，加入浓度为0.1~0.5 mM的IPTG，于18℃~25℃诱导10~16小时，然后超声破碎，离心取上清液，得到重组的可溶性融合蛋白Trx-Tx4(6-1)；

S3：Trx-Tx4(6-1)融合蛋白的纯化：利用镍亲合层析柱对Trx-Tx4(6-1)融合蛋白进行纯化，先用含10 mM咪唑的pH 8.0 Tris-HCl溶液漂洗亲合层析柱，然后用含20~400 mM咪唑的pH 8.0 Tris-HCl溶液将融合蛋白洗脱下来，即可得纯度在90%以上的Trx-Tx4(6-1)融合蛋白；

S4：Trx标签的切割及重组Tx4(6-1)蛋白的纯化：将表达得到的融合蛋白用肠激酶切割，再利用截留分子量为10 kDa的透析袋在pH值为6.5~6.6的5~10 mM Tris-HCl透析缓冲液中透析，将透析后所得的透析缓冲液，利用CM阳离子柱吸附后用10~30 mM NaCl溶液漂洗，再用100~150 mM NaCl洗脱，即可得高纯度的Tx4(6-1)重组蛋白。

本发明提供的技术方案具有以下优点：一是利用pET32载体和大肠杆菌表达菌株，实现了表达产物与增溶因子Trx融合，得到大量可溶性Trx-Tx4(6-1)融合蛋白；二是在本发明的表达系统内，Trx-Tx4(6-1)融合蛋白可按适当的方式折叠，并保持天然构象；三是摸索出一条有效纯化活性重组Trx-Tx4(6-1)、快速切割Trx并进一步纯化得到无任何标签的Tx4(6-1)重组蛋白得方法；四是通过大肠杆菌表达得到的Tx4(6-1)蛋白具有很高的生物活性。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1为本发明实施例中的pET32/Tx4(6-1)载体构建示意图；

图2为本发明实施例中含有优化的Tx4(6-1)的pET16、pET20、pET28、pET36和pET32重组载体表达的可溶性目标蛋白的SDS-PAGE检测结果图；

图3为本发明实施例中的包含优化后基因的pET32/Tx4(6-1)载体的大肠杆菌表经优化表达条件下，表达得到的可溶性Trx-Tx4(6-1)融合蛋白的SDS-PAGE检测结果图；

图4为本发明实施例中的纯化前Trx-Tx4(6-1)融合蛋白和用包括不同浓度的咪唑的缓冲液C纯化得到的Trx-Tx4(6-1)融合蛋白的SDS-PAGE检测结果图；

图5为本发明实施例中的Trx-Tx4(6-1)融合蛋白在酶切得到的蛋白的SDS－PAGE检测结果图；

图6为本发明实施例中的rTx4(6-1)重组蛋白的SDS-PAGE检测结果图；

图7为本发明实施例中的注射rTx4(6-1)重组蛋白组家蚕在注射1小时后，拍照的结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到；实施例中的%，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。

本发明选用大肠杆菌表达菌、载体扩增菌株TOP10和表达载体pET32均购自美国Invritrogen公司。本发明中的引物具体序列如序列表中的序列3和序列4所示，利用序列3和序列4的引物扩增的目标基因同样可以进行相关的酶切和连接操作。

所用培养基配方如下：

1）LB液体培养基：NaCl 10 g，蛋白胨10 g，酵母提取物 5 g，蒸馏水1 L，高压灭菌，室温保存；

2）LB/Amp平板：NaCl 10 g，蛋白胨10 g，酵母提取物 5 g，蒸馏水1 L，琼脂粉15 g，高压灭菌后，冷却至70℃以下，加入1 mL浓度为100mg/ml的氨苄青霉素（Ampicillin），充分混均后倒板，4℃避光保存；

3）LB/Amp培养基：NaCl 10 g，蛋白胨10 g，酵母提取物 5 g，蒸馏水1 L，高压灭菌后，冷却至70℃以下，加入1mL Ampicillin（100mg/ml），充分混均，4℃保存；LB液体培养基：NaCl 10 g，蛋白胨10 g，酵母提取物 5 g，蒸馏水1 L，高压灭菌，室温保存；

4）50× TAE琼脂糖凝胶电泳缓冲液：Tris碱121 g，冰乙酸28.6 mL，0.5 mol/L EDTA （pH 8.0) 50 mL，加蒸馏水定容至500 mL，室温保存；

5）50 mg/mL氨苄青霉素保存液：氨苄青霉素0.5 g，加蒸馏水溶解并定容至10 mL，分装后于-20 ℃保存；

6）5×SDS-PAGE上样缓冲液：1 M Tris-HCl （pH 6.8) 1.25 mL，SDS 0.5 g，BPB 25 mg，甘油 2.5 mL，加去离子水溶解后定容至5 mL，分装（约500 μL每份）后于室温保存，使用每份加入25 μL β-巯基乙醇混匀；

7）5×SDS-PAGE电泳缓冲液：Tris 15.1 g，甘氨酸 94 g，SDS 5.0 g，加入约800 mL去离子水，充分搅拌溶解后定容至1 L，室温保存；

8）考马斯亮蓝R-250染色液：考马斯亮蓝R-250 0.25g，加入225 mL甲醇、46 mL的冰乙酸、225 mL去离子水并搅拌均匀，滤纸去除颗粒物质后，室温保存；

9）考马斯亮蓝脱色液：冰乙酸 50 mL，甲醇 150mL，去离子水300 mL，充分混合后，室温保存。

实施例一

本实施例提供了一种优化的人工合成的Tx4(6-1)基因，具体序列如序列表中的序列1所示，该基因所对应的蛋白质序列如序列表中的序列2所示。本实施例的优化前的序列是根据NCBI数据库提供的DNA序列，是合成Tx4(6-1)神经毒素的天然DNA，根据大肠杆菌表达的特点，优化并合成优化后的DNA。NCBI数据库仅能找到Tx4(6-1)的天然蛋白序列(GenBank登录号2108421A)而没有其对应的核酸序列，因此优化合成的Tx4(6-1)基因没有同源DNA序列。

将上述优化前后的基因连接到大肠杆菌表达载体pET系列中并获得重组载体，以上经测序验证的重组载体分别热激转化到大肠杆菌表达菌株的感受态细胞，涂布对应的抗性LB平板，37℃ 恒温培养箱中培养12小时，筛选转化子，其中pET32/Tx4(6-1)载体构建如图1所示，图1为本发明实施例中的pET32/Tx4(6-1)载体构建示意图。

利用含未经优化的天然Tx4(6-1)基因序列的pET系列重组载体为表达载体，其对应的表达菌转化子经0.5 mM的IPTG在37℃下诱导均未检测到目标蛋白的表达，其菌体总蛋白SDS-PAGE结果如图2所示，图2为本发明实施例中含有优化的Tx4(6-1)的pET系列重组载体表达的目标蛋白的SDS-PAGE检测结果图。利用含优化后的Tx4(6-1)基因序列的pET系列重组载体为表达载体，其对应的表达菌转化子经0.5 mM的IPTG在37℃下诱导，其中以pET18、pET20、pET28和pET36为重组表达载体的转化子未检测到目标蛋白的表达，以pET32为表达载体检测到目标蛋白的表达，Tx4(6-1)蛋白分子量约为7 kDa，pET32载体在目标蛋白的N－端融合了一个大小为18 kDa左右的Trx片段，Trx-Tx4(6-1)大小为25 kDa左右，表达的目标蛋白如箭头所示。

实施例二

本实施例提供一种制备蛋白的方法，具体包括如下步骤：

S1：优化基因、构建原核表达载体及转化：人工合成经优化的成熟蝎昆虫神经毒素Tx4(6-1)基因，并连接至表达载体pET32中，得到重组表达载体pET32/Tx4(6-1)，载体构建如图1所示。主要的载体构建步骤如下：

（1）用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切重组载体Tx4(6-1)/pUC，获得目的片断PCP，反应体系如下（所用内切酶及缓冲液均购自大连TAKARA公司）：

载体Tx4(6-1)/pUC 15 μL

10×H 缓冲液 5μL

BamH Ⅰ 5U

HindⅢ 5U

无菌水 至50μL

（2）用BamHⅠ和HindⅢ双酶切pET32，获得载体片断，反应体系如下（所用内切酶及缓冲液均购自大连TAKARA公司）：

载体pET32 15 μL

10×H 缓冲液 5μL

BamHⅠ 5U

HindⅢ 5U

无菌水 至50μL

（3）将步骤（1）和（2）得到的目的片断和载体片断用DNA凝胶收回试剂盒回收，该试剂盒购自大连TAKARA公司，具体操作按试剂盒说明书进行。

（4）将步骤（3）回收得到的目的片断和载体用T4DNA连接酶（购自大连TAKARA公司）进行连接反应，目的基因准确插入载体读码框内，反应体系如下：

载体pET32片段 1μL

目的片段落 3μL

10× 缓冲液 1μL

T4连接酶 0.5μL

无菌水 至10μL

将重组载体pET32/Tx4(6-1)转化到大肠杆菌TOP10菌株中，再从TOP10中提取重组载体pET32/Tx4(6-1)；用热激法将重组载体pET32/Tx4(6-1)转入到宿主细胞大肠杆菌表达菌株中，用含有Amp抗性的LB平板筛选得到包含有重组载体pET32/Tx4(6-1)的大肠杆菌表达菌株转化子。

S2：可溶性Trx-Tx4(6-1)融合蛋白的表达与提取：将包含优化后基因的pET32/Tx4(6-1)载体的大肠杆菌重组转化子在37℃的液体LB培养基中培养至OD₆₀₀为0.6，然后分别加入浓度为0、0.1、0.5和1.0 mM的IPTG，分别在18℃、25℃和37℃诱导12小时，诱导后收集的菌体超声破碎，破碎功率300 W，破碎5 s，间隙9 s，循环90次后，离心取上清液，得到重组的可溶性融合蛋白Trx-Tx4(6-1)。

S3：Trx-Tx4(6-1)融合蛋白的纯化：经扩大培养和在18℃下用0.1 mM IPTG诱导12小时，收集经IPTG诱导表达后后的表达菌的菌体，将菌体重悬于50 ml 的缓冲液A（含20 mM Tris-HCl，100 mM NaCl，10 mM 咪唑和1 mM 蛋白酶抑制剂 PMSF，pH 8.0）中，然后用超声破碎仪进行破碎，破碎功率300 W，破碎5 s，间隙9 s，循环90次；将破碎后的菌液在4℃下，30000 g离心15 min；将离心所得到的上清液加入到经缓冲液A预平衡的镍亲合层析柱中；用100 ml缓冲液B（含20 mM Tris-HCl，100 mM NaCl，10 mM咪唑和0.5-1.0% Triton X-114，pH 8.0，先于冰浴上预冷至0℃-4℃）漂洗蛋白纯化柱子后，分别加入包括浓度为20~400 mM咪唑的缓冲液C（含20 mM Tris-HCl，100 mM NaCl，pH 8.0），将蛋白洗脱下来，即可得纯度在90%以上的Trx-Tx4(6-1)融合蛋白。

S4：Trx标签的切割及重组Tx4(6-1)蛋白的纯化：取1 mg Trx-Tx4(6-1)融合蛋白，加入2~3 U的重组小牛肠激酶，于25℃下进行酶切6小时取样。酶切完成后，利用截留分子量为10 kDa的透析袋在pH值为6.5~6.6的5~10 mM Tris-HCl透析缓冲液中透析，将透析后所得的透析缓冲液，利用CM阳离子柱吸附后用10~30 mM NaCl溶液漂洗，再用100~150 mM NaCl洗脱，以即可得纯度达95%以上的Tx4(6-1)重组蛋白，从1 L大肠杆菌菌体中最终可获得10 mg的高纯度Tx4(6-1)重组蛋白。

需要说明的是， 在步骤S2得到的上清液中加入SDS-PAGE样品缓冲液，对其可溶蛋白进行分析。在18℃、25℃和37℃温度下IPTG的浓度为0.1 mM、0.5 mM和1.0 mM时，都可以得到可溶性Trx-Tx4(6-1)融合蛋白，具体结果如图3所示，图3为本发明实施例中的包含优化后基因的pET32/Tx4(6-1)载体的大肠杆菌表达得到的可溶性Trx-Tx4(6-1)融合蛋白的SDS-PAGE检测结果图。其中，在18℃时，在供试浓度范围内，可溶性Trx-Tx4(6-1)均可高水平表达；在25℃时，在IPTG的浓度为0.1 mM-0.5 mM时有较高水平的可溶性Trx-Tx4(6-1)表达。为节约成本，缩短生产周期，我们优选采用诱导温度18℃-25℃，0.1~0.5 mM的IPTG进行诱导表达。

对于步骤S3，结果显示利用包括100~400 mM的咪唑缓冲液C洗脱可以得到纯度达90%的重组蛋白，融合蛋白的分子量约为25 kDa，表达产物可溶性Trx-Tx4(6-1)的纯化过程的优化如图4所示，图4为本发明实施例中的纯化前Trx-Tx4(6-1)融合蛋白和用包括不同浓度的咪唑的缓冲液C纯化得到的Trx-Tx4(6-1)融合蛋白的SDS-PAGE检测结果图。

对于步骤S4，用SDS-PAGE分析酶切效果，结果如图5所示。经4小时酶切即可获得经切割的rTx4(6-1)蛋白（目标蛋白如箭头所示），再利用截留分子量为10 kDa的透析袋在pH值为6.5~6.6的5~10 mM Tris-HCl透析缓冲液中透析，将透析后所得的透析袋外侧缓冲液，利用CM阳离子柱吸附后用10~30 mM NaCl溶液漂洗，再用100~150 mM NaCl洗脱，即可得高纯度的不带标签的rTx4(6-1)重组蛋白。rTx4(6-1)重组蛋白的SDS-PAGE检测结果如图6所示。

将纯化后的重组蛋白rTx4(6-1)进行生物学活性分析，具体分析方法和结果如下。

实验方法：纯化的Trx-Tx4(6-1)融合蛋白（A组）和纯化的rTx4(6-1)蛋白（B组）分别稀释至2 mg/ml，按10 μg/g体重注射4龄家蚕各30只，同时以注射相同体积PBS（C组）的4龄家蚕作为对照，观察4龄家蚕的中毒症状。

实验结果：结果发现，注射纯化的rTx4(6-1)蛋白的家蚕立即表现出强烈的神经毒素中毒症状，并在24小时内所有家蚕全部死亡，注射纯化的Trx-Tx4(6-1)融合蛋白的家蚕未表现出明显神经系统中毒症状，24小时内死亡率为10%，而注射相同体积PBS的对照组家蚕无一出现中毒症状。其中注射纯化的rTx4(6-1) 家蚕和和PBS的对照组在1注射小时后观察到的结果如图7所示，其中注射组表现出显著的收缩症状。生物学活性检测结果表明，本发明技术方案制备的rTx4(6-1)蛋白具有很强的生物活性。具体结果如下表1所示：

表1 A、B、C和D组生物学活性分析结果（n=3）。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、 “示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型，而并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。

SEQUENCE LISTING

<110> 怀化学院

<120> 一种毒素Tx4(6-1)无标签重组蛋白的生产方法

<130> 2016-12-15-

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 147

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgtggtgaca tcaacgctgc ttgtaaagaa gactgtgact gttgtggtta cactacagct 60

tgtgactgtt actggtctaa atcttgtaag tgtagagaag ctgctatcgt tatctacact 120

gctcctaaaa agaaattgac atgttaa 147

<210> 2

<211> 48

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Cys Gly Asp Ile Asn Ala Ala Cys Lys Glu Asp Cys Asp Cys Cys Gly

1 5 10 15

Tyr Thr Thr Ala Cys Asp Cys Tyr Trp Ser Lys Ser Cys Lys Cys Arg

20 25 30

Glu Ala Ala Ile Val Ile Tyr Thr Ala Pro Lys Lys Lys Leu Thr Cys

35 40 45

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcctcgagtg tggtgacatc aacgctg 27

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gctctagatc acatgtcaat ttctttttag 30