蝎神经毒素AaIT重组基因及其蛋白的制备方法与应用与流程

本发明涉及生物
技术领域：
，具体涉及一种蝎神经毒素AaIT重组基因及其蛋白的制备方法与应用。
背景技术：
：昆虫神经毒素是一类只作用于昆虫神经系统，有毒杀作用的多肽类神经毒素，主要来自于蝎，其次来自蜘蛛。这类对昆虫有专一毒杀作用的毒素的作用位点是各种离子通道，具有高效昆虫专一性的神经毒素主要是作用于钠离子通道的长链神经毒素，这类长链神经毒素一般由60-70个氨基酸组成，有2-4对链内二硫键。不同种属来源的神经毒素在氨基酸的组成上没有明显的保守性，而同种来源神经毒素在一级结构上具有很高的保守性。AaIT是由TalArnon从蝎子Androctonusaustralis的毒液中分离到的一种对昆虫具有高度选择性的作用于钠离子通道的α-型昆虫神经毒素，该成熟神经毒素由64个氨基酸残基组成，对农业害虫具有很强的毒杀作用，天然毒素对鳞翅目、直翅目和双翅目害虫的半数瘫痪剂量(PD50)为几钠克至几十钠克/g体重，因此该毒素在农业害虫的防治上具有潜在的应用价值。虽然昆虫神经毒素具有控制农业害虫的重要潜在价值，但天然昆虫神经毒素在毒腺中的含量低且提取困难的，并且往往只能得到非常少量的纯品，这就给我们进一步研究这些毒素的特性带来了很大的困难。现有技术中将昆虫神经毒素构建表达载体，然后转化到E.coliBL21(DE3)进行表达，但得到的都是无活性的包涵体，通过在体外合适的条件下进行溶解、变性、复性和纯化，从每升培养基仅能得到微量的可溶性蛋白质，生产量低；也存在将构建的表达载体在酵母中表达的方法，但其表达量低且分离纯化困难。目前，还没有通过改造AaIT的DNA序列且优化AaIT表达纯化方法来高效生产AaIT重组蛋白的方式，极大影响了AaIT活性测定、杀虫谱分析和AaIT在抗虫中的应用，因此亟需开发出一种可以降低成本、实现大量生产具有生物活性且具备毒害昆虫专一性的昆虫神经毒素AaIT的方法。技术实现要素：针对现有技术中的缺陷，本发明目的在于提供一种蝎神经毒素AaIT重组基因及其蛋白的制备方法与应用。本发明提供基因，为编码蝎神经毒素AaIT类蛋白的基因，为如下(1)-(3)中任意一种的DNA分子：(1)由序列表中序列1所示的DNA分子；(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码具有毒杀昆虫活性的蛋白的DNA分子；(3)与(1)限定的DNA序列至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码具有毒杀昆虫活性的蛋白的DNA分子。严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5MNaPO4和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5MNaPO4和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5MNaPO4和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5MNaPO4和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次。其中，序列表中的序列1由231个脱氧核苷酸组成，本序列包括AaIT基因的成熟蛋白全长读码框和6个组氨组成的表达标签和终止密码子，编码具有序列表中序列2的氨基酸残基序列的蛋白质。由上述序列表中的序列1编码得到的蛋白属于本发明的保护范围。本发明提供蛋白，是如下(1)或(2)：(1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有毒杀昆虫活性的由序列2衍生的蛋白质。其中，序列表中的序列2由76个氨基酸残基组成，其中1-70为成熟AaIT蛋白氨基酸序列，71-76为6个组氨组成的表达标签，其编码基因的读码框包含231个核苷酸(包含一个终止密码子)。一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。含有上述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。重组载体具体为将上述基因插入表达载体中，得到表达上述蛋白的重组载体。重组载体具体优选为将上述基因插入表达载体pPICZαA的XhoI和XbaI酶切位点间，得到表达上述蛋白的重组载体。扩增基因全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。上述引物对中的一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列3(GCCTCGAGAAAAGAAAAAAGAACGGTTACGCT)，引物对中的另一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列4(GCTCTAGATCAGTTGATGATAGTAGTGTCAC)，利用序列3和序列4的引物扩增的目标基因同样可以进行相关的酶切和连接操作。本发明的第二个目的是提供一种制备蛋白的方法，包括以下步骤：S1：将基因和表达载体pPICZα分别用XhoI和XbaI双酶切并纯化回收，然后利用连接酶在16℃连接，得重组载体pPICZαA-AaIT；S2：将重组载体pPICZαA-AaIT用SacI单酶切线性化，并用氯化锂转化法转化到毕赤酵母宿主菌中，再经过Zeocin筛选得到阳性克隆；S3：将阳性克隆转接至含有1500～2000μg/mLZeocin(盐酸博莱霉素)的YPD平板，筛选得到高Zeocin抗性的转化子，将高抗性转化子用BMGY培养基培养至OD600为10～15，离心收集细胞沉淀，用BMMY培养基重悬细胞，加入甲醇并使其质量分数为1.0％～1.5％，诱导72小时，收集发酵的上清液；在诱导表达之前，优选地将高Zeocin抗性的转化子用BMMY小量诱导表达，筛选得到高水平分泌表达目标蛋白的转化子，再用BMGY培养基培养诱导表达。优选地，在步骤S3的诱导72小时之后且收集发酵的上清液之前，还包括进一步诱导表达的如下步骤：S31：在28℃继续诱导培养72小时，每24小时补加甲醇使其质量分数保持在1.0％～1.5％。优选地，在步骤S3之后，还包括纯化蛋白的如下步骤：S4：将上清液利用Tris碱调节pH至7.5～8.5，以大于或等于15000g的转速离心10～20分钟，将获得的上清液加入到经pH8Tris-HCl缓冲液平衡后的镍亲合层析柱中，用2～4倍层析柱体积的pH8的含10mMTris-HCl和30mM～50mM咪唑的缓冲液漂洗镍亲合层析柱；S5：用含10mMTris-HCl和100～400mM咪唑的缓冲液洗脱镍亲合层析柱，将得到的洗脱液利用分子量为3kDa的透析袋于10mMTris-HCl缓冲液中透析，然后超滤浓缩。优选地，在步骤S5之后，还包括保存蛋白的如下步骤：S6：将超滤浓缩得到的产品在-80℃下速冻，然后冷冻干燥。根据上述任一种制备蛋白的方法制备得到的蛋白也属于本发明的保护范围。通过步骤S3筛选得到的稳定且能高水平分泌表达蝎昆虫神经毒素AaIT的酵母转化子也属于本发明保护的范围。上述蛋白、上述基因或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在抗虫领域中的应用也是本发明保护的范围。本发明的第三个目的是提供一种培育转基因植物的方法，是将上述蛋白的编码基因导入到目的植物中，得到转基因植物，转基因植物的抗虫性高于目的植物。上述转基因植物理解为不仅包含将基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。将基因导入目的植物，会使蛋白质目的植物中合成，进而是目的植物的抗虫性能得到改良。本发明还提供一种培育转基因病毒的方法，是将上述蛋白的编码基因转入到目的病毒中，得到转基因病毒，转基因病毒的抗虫性高于目的病毒，目的病毒优选为杆状病毒、核型多角体病素和质型多角体病毒中的一种。本发明提供的技术方案具有以下优点：一是根据本技术方案的表达方法分泌表达和纯化得到的具有生物活性的重组蝎昆虫神经毒素AaIT能够有效防止宿主菌对表达产物的降解，减轻宿主细胞代谢的负荷和表达产物对宿主的毒性作用；二是利用酵母载体pPICZαA-AaIT上的分泌信号α-因子信号肽引导目的蛋白的基因分泌表达，目的蛋白会大量分泌到培养液中，且能形成准确的空间结构，从而保持蝎昆虫神经毒素AaIT的天然活性；三是通过筛选得到了稳定且能高水平分泌表达得蝎昆虫神经毒素AaIT的酵母转化子；四是摸索出用真核宿主毕赤酵母来表达昆虫神毒素AaIT的方法和快速高效纯化蝎昆虫神经毒素AaIT的方法，可以降低成本且实现大量生产；五是纯化的带组氨酸标签的重组蛋白对昆虫细胞有毒性而对哺乳动物细胞未检测到毒性即该毒素，也就是保持了毒害昆虫的专一性。本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。附图说明图1为本发明实施例中的真核表达载体pPICZαA-AaIT构建示意图；图2为本发明实施例中不同Zeocin抗性的昆虫神经毒素AaIT的酵母转化子的SDS-PAGE检测结果图；图3为本发明实施例中在甲醇诱导下不同时间点目标蛋白表达情况的SDS-PAGE检测结果图；图4为本发明实施例中不同浓度的咪唑洗脱纯化得到的AaIT蛋白的SDS-PAGE检测结果图；图5为本发明实施例中纯化得到的AaIT蛋白的SDS-PAGE检测结果图；图6为本发明实施例中优化后的重组AaIT蛋白的生物学活性结果示意图。具体实施方式下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。本发明选用毕赤酵母菌株和整合性表达质粒pPICZαA均购自美国Invritrogen公司。本发明中的引物具体序列如序列表中的序列3和序列4所示，利用序列3和序列4的引物扩增的目标基因同样可以进行相关的酶切和连接操作。所用培养基配方如下：1)酵母生长培养基(BMGY)：完全溶解10g酵母提取物，20g蛋白胨，定容到800mL。121℃蒸气高压灭菌15-20min，冷却到室温，加入100mL1M磷酸钾溶液，100mIYNB，2mL500×生物素，20mL50％灭菌甘油；2)酵母诱导培养基(BMMY)完全溶解10g酵母提取物，20g蛋白胨，定容到800mL。121℃蒸气高压灭菌15-20min，冷却到室温，加入100mL1M磷酸钾溶液，100mLYNB，2mL500×生物素，10mL甲醇；3)YPD培养基完全溶解10g酵母提取物，20g蛋白胨，定容到900mL，121℃蒸气高压灭菌15-20min，冷却至70℃左右再加入100mL20％灭菌葡萄糖溶液。在其中加入1.5-1.8％的琼脂可制得YPD固体培养基。4)YPG培养基完全溶解10g酵母提取物，20g蛋白胨，20g甘油，定容到1000mL，121℃蒸气高压灭菌15-20min。实施例一本实施例提供了一种优化的人工合成的C-端带有6×His标签的AaIT基因，具体序列如序列表中的序列1所示，该基因所对应的蛋白质序列如序列表中的序列2所示。本实施例的优化前的序列是根据NCBI数据库提供的DNA序列，是合成AaIT神经毒素的天然DNA，然后根据毒素基因和毕赤酵母密码子表达特点，优化并合成优化后的DNA。优化后的DNA序列与AaIT的天然多核苷酸(GenBank登录号M27706)经NCBI比对，没有明显相似性。将优化前的AaIT神经毒素的天然DNA和优化后的人工合成的C-端带有6×His标签的DNA分别连接至毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαA上，得到重组载体，然后利用Invitrogen公司操作手册提供的氯化锂转化法分别将重组载体转化到毕赤酵母宿主菌X-33中，转化后分别用含有100μg/mLZeocin抗生素的YPD平板进行筛选，利用PCR对转化子进行验证，将PCR验证后的毕赤酵母转化子划线分别接种至含有不同浓度的Zeocin抗生素的YPD平板，分别筛选得到含优化前的AaIT神经毒素的天然DNA的高抗性的毕赤酵母转化子和含优化后的人工合成的C-端带有6×His标签的DNA的高抗性的毕赤酵母转化子，然后分别用BMMY小量诱导表达，再进行SDS-PAGE分析。分析结果显示用优化前的AaIT神经毒素的天然DNA构建得到的毕赤酵母转化子不会表达目标蛋白，而用优化后的人工合成的C-端带有6×His标签的DNA构建得到的毕赤酵母转化子能表达并分泌目标蛋白。实施例二本实施例提供一种制备蛋白的方法，具体包括如下步骤：S1：构建表达载体及转化：将实施例一的优化后的人工合成的C-端带有6×His标签的DNA连接至毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαA，得到重组载体pPICZαA-AaIT，载体构建如图1所示，图1为本发明实施例中的真核表达载体pPICZαA-AaIT构建示意图。主要的载体构建步骤优选如下：(1)用XhoI和XbaI双酶切含合成的AaIT基因的质粒，获得目的片断，反应体系如下(所用内切酶及缓冲液均购自大连TAKARA公司)：(2)用XhoI和XbaI双酶切pPICZαA，获得载体片断，反应体系如下(所用内切酶及缓冲液均购自大连TAKARA公司)：(3)将步骤(1)和(2)得到的目的片断和载体片断用DNA凝胶收回试剂盒回收，该试剂盒购自大连TAKARA公司，具体操作按试剂盒说明书进行。(4)将步骤(3)回收得到的目的片断和载体用T4DNA连接酶(购自大连TAKARA公司)进行连接反应，目的基因准确插入到含有分泌信号α-因子的分泌型载体读码框内，反应体系如下：S2：重组质粒的转化：将重组载体pPICZαA-AaIT用SacI单酶切线性化，按照Invitrogen公司操作手册提供的氯化锂转化法，将重组载体转化到毕赤酵母宿主菌中，本实施例选用的是X-33。转化后用含有100μg/mLZeocin抗生素的YPD平板进行筛选，利用PCR对转化子进行验证。S3：高水平分泌表达酵母转化子的筛选和蛋白的表达：将PCR验证后的毕赤酵母转化子划线接种至含有不同浓度的Zeocin抗生素的YPD平板，筛选得到高Zeocin抗性的转化子，将高抗性的转化子用BMMY小量诱导表达，筛选得到高水平分泌表达目标蛋白的转化子，选取高水平分泌表达的酵母转化子单菌落，接种至装有50mLYPD液体培养基的250mL三角瓶中，在28℃，300rpm培养条件下培养至菌体OD600＝6.0，取上述菌液，接种至含500mLBMGY培养基的2000mL摇瓶中，每甁接种5mL，于28℃，250rpm培养至OD600＝12；室温下2500g离心5min，收集菌体，用1/7原培养体积的BMMY重悬菌体，向培养基中添加100％甲醇至终浓度(质量分数)为1.3％，在28℃诱导培养，每24小时补加甲醇使其质量分数保持在1.3％，并收集发酵的上清液。需要说明的是，将高Zeocin抗性的转化子用BMMY小量诱导表达，经SDS-PAGE分析，从十株高抗性(抗性水平大于或等于1500μg/mLZeocin)转化子中筛选得到一株稳定且高水平分泌表达昆虫神毒素AaIT的酵母转化子，而从50株抗性水平低于1500μg/mLZeocinYPD平板的转化子没有筛选到高水平分泌表达目标蛋白的转化子，部分转化子筛选的SDS-PAGE结果如图2所示，图2为本发明实施例中不同Zeocin抗性的昆虫神经毒素AaIT的酵母转化子的SDS-PAGE检测结果图。用SDS-PAGE检测甲醇诱导下不同时间目标蛋白表达情况分析，电泳结果如图3所示，图3为本发明实施例中在甲醇诱导下不同时间点目标蛋白表达情况的SDS-PAGE检测结果图。经诱导1～4天，在10kDa左右均有明显目的蛋白表达，且通过继续补加甲醇，诱导得到的目的蛋白含量更高，具体目的蛋白占上清液蛋白的总量结果如下表1所示。表1不同诱导时间得到的目的蛋白占上清液蛋白的百分比含量结果诱导时间1天2天3天4天百分比含量(％)9263935实施例三本实施例提供一种制备蛋白的方法，具体包括如下步骤：S1：将实施例一的优化后的人工合成的C-端带有6×His标签的DNA连接至毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαA，得到重组载体pPICZαA-AaIT，载体构建如图1所示。主要的载体构建步骤优选如下：(1)用XhoI和XbaI双酶切含合成的AaIT基因的质粒，获得目的片断，反应体系如下(所用内切酶及缓冲液均购自大连TAKARA公司)：(2)用XhoI和XbaI双酶切pPICZαA，获得载体片断，反应体系如下(所用内切酶及缓冲液均购自大连TAKARA公司)：(3)将步骤(1)和(2)得到的目的片断和载体片断用DNA凝胶收回试剂盒回收，该试剂盒购自大连TAKARA公司，具体操作按试剂盒说明书进行。(4)将步骤(3)回收得到的目的片断和载体用T4DNA连接酶(购自大连TAKARA公司)进行连接反应，目的基因准确插入到含有分泌信号α-因子的分泌型载体读码框内，反应体系如下：S2：将重组载体pPICZαA-AaIT用SacI单酶切线性化，按照Invitrogen公司操作手册提供的氯化锂转化法，将重组载体转化到毕赤酵母宿主菌中，本实施例选用的是X-33。转化后用含有100μg/mLZeocin抗生素的YPD平板进行筛选，利用PCR对转化子进行验证。S3：将PCR验证后的毕赤酵母转化子划线接种至含有不同浓度的Zeocin抗生素的YPD平板，筛选得到高Zeocin抗性的转化子，将高抗性的转化子用BMMY小量诱导表达，筛选得到高水平分泌表达目标蛋白的转化子，选取高水平分泌表达的酵母转化子单菌落，接种至装有50mLYPD液体培养基的250mL三角瓶中，在28℃，300rpm培养条件下培养至菌体OD600＝6.0，取上述菌液，接种至含500mLBMGY培养基的2000mL摇瓶中，每甁接种5mL，于28℃，250rpm培养至OD600＝12；室温下2500g离心5min，收集菌体，用1/7原培养体积的BMMY重悬菌体，向培养基中添加100％甲醇至终浓度(质量分数)为1.3％，诱导72小时，每24小时补加甲醇使其质量分数保持在1.3％，收集发酵的上清液。S4：将得到的上清液于4℃离心，收集离心后的上清液，利用Tris碱调节pH至8.0，以15000g的转速离心15分钟，将获得的上清液加入到经pH8Tris-HCl缓冲液平衡后的镍亲合层析柱中，用3倍层析柱体积的pH8的含10mMTris-HCl和40mM咪唑的缓冲液漂洗镍亲合层析柱。S5：用含10mMTris-HCl和100、200和400mM咪唑的缓冲液洗脱镍亲合层析柱并收集洗脱液，将洗脱液利用分子量3kDa的透析袋于10mMTris-HCl缓冲液中透析后超滤浓缩。S6：浓缩产品于-80℃冰箱中速冻后冷冻干燥，即得高纯度的重组AaIT蛋白冻干粉。需要说明的是，将步骤S5洗脱下来的纯化蛋白进行SDS-PAGE分析，结果如图4所示，图4为本发明实施例中不同浓度的咪唑洗脱纯化得到的AaIT蛋白的SDS-PAGE检测结果图。从结果可以看出，先利用40mM咪唑的漂洗液可以将大量杂蛋白去除，再利用100mM、200mM和400mM咪唑的缓冲液洗脱层析柱时均能洗脱得到高纯度的目标蛋白。将洗脱液利用分子量3kDa的透析袋于10mMTris-HCl缓冲液中透析后利用截留分子量3kDa的15mL超滤管将样品浓缩20倍。取20微克的纯化蛋白，SDS-PAGE检测结果如图5所示，仅在目标位有蛋白条带，说明得到了高纯化的AaIT重组蛋白。对比例人工合成并优化蝎神经毒素AaIT天然DNA，在该基因的5′-端添加金龟子绿僵菌基因MCL1，并克隆入pBarPc的SmaI酶切位点得到质粒pMcl1prAaIT，经SwaI酶切、线性化后使用真菌原生质体的方法进行金龟子绿僵菌菌株ARSEF549转化，筛选获得遗传稳定的转化子AaIT-549，转化子AaIT-549在昆虫血液离体培养表达，并纯化得到AaIT蛋白。本实施例提供的技术方案目的蛋白AaIT的表达量显著提高，从S3收集发酵的上清液，经过步骤S4和S5纯化，从1L的诱导培养液中可以纯度在95％以上的AaIT蛋白近50mg，而对比例中，从1L的培养液中仅可以得到纯度为50％的蛋白2.4mg，并且对比例需要利用昆虫血液离体培养，生产成本高。将对比例纯化得到AaIT蛋白(A组)、实施例二得到的纯化前的AaIT蛋白(B组)和实施例三经过纯化步骤S4和S5得到的纯化后的AaIT蛋白(C组)进行生物学活性分析，具体分析方法和结果如下。实验方法：在10cm培养皿中将昆虫细胞SF9于昆虫细胞培养基中培养至90％生长密度，胰酶消化并将细胞浓度调整至5×105cell/mL，向96孔细胞培养板中每孔加入100μl的昆虫SF9细胞悬液，培养过夜后，向各培养孔分别加入不同终浓度的A、B或C组的AaIT蛋白(0、1、5、10、20ng/ml)，每个浓度3个平行孔，将上述细胞于标准条件下培养48小时，显微镜下测定细胞的生长成况，。同样将人成纤维细胞NIH/3T3细胞用含10％小牛血清的DMEM培养基中培养至90％生长密度，胰酶消化并将细胞浓度调整至5×105cell/mL，向96孔细胞培养板中每孔加入100μl的NIH/3T3细胞悬液，培养过夜后，各培养孔分别加入不同终浓度A、B或C组的AaIT蛋白(0、1、5、10、20ng/ml)，每个浓度3个平行孔，将上述细胞于标准条件下培养48小时，显微镜下测定细胞的生长成况。实验结果：图6为本发明实施例中优化后的重组AaIT蛋白的生物学活性结果示意图。如图6所示，1ng/ml的重组AaIT蛋白就能抑制昆虫细胞SF9的生长，当浓度达到20ng/ml时细胞已经大量死亡，而在测试范围内，毒素对NIH/3T3细胞未表现出毒性，具体结果如下表2所示。细胞增殖活性测定结果表明，本发明所采用的方法制备的AaIT重组蛋白具有很高的生物学活性，并且保持毒害昆虫的专一性，而对比例中制备得到的AaIT蛋白活性较低。表2A、B和C组的AaIT蛋白生物学活性分析结果在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型，而并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。当前第1页1 2 3