蝎神经毒素AaIT重组基因及其蛋白的制备方法与应用与流程

文档序号:12411914阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种基因,是如下(1)-(3)中的任一种DNA分子:

(1)由序列表中序列1所示的DNA分子;

(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码具有毒杀昆虫活性的蛋白的DNA分子;

(3)与(1)限定的DNA序列至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码具有毒杀昆虫活性的蛋白的DNA分子。

2.根据权利要求1所述的DNA分子编码得到的蛋白。

3.根据权利要求2所述的蛋白,其特征在于:是如下(1)或(2):

(1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质;

(2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有毒杀昆虫活性的由序列2衍生的蛋白质。

4.含有权利要求1所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌;

所述重组载体具体为将权利要求1所述的基因插入表达载体中,得到表达权利要求2或3所述蛋白的重组载体,所述重组载体具体优选为将上述基因插入表达载体pPICZαA的Xho I和Xba I酶切位点间,得到表达上述蛋白的重组载体。

5.一种利用权利要求1所述的基因制备蛋白的方法,包括以下步骤:

S1:将权利要求1所述的基因和表达载体pPICZα分别用Xho I和Xba I双酶切并纯化回收,然后利用连接酶在16℃连接,得重组载体pPICZαA-AaIT;

S2:将所述重组载体pPICZαA-AaIT用Sac I单酶切线性化,并用氯化锂转化法转化到毕赤酵母宿主菌中,再经过Zeocin筛选得到阳性克隆;

S3:将所述阳性克隆转接至含有1500~2000μg/mL Zeocin的YPD平板,筛选得到高Zeocin抗性的转化子,将所述高抗性转化子用BMGY培养基培养至OD600为10~15,离心收集细胞沉淀,用BMMY培养基重悬细胞,加入甲醇并使其质量分数为1.0%~1.5%,诱导72小时收集发酵的上清液。

6.根据权利要求5所述的制备蛋白的方法,其特征在于:在步骤S3的诱导24小时之后且收集发酵的上清液之前,还包括如下步骤:

S31:在28℃继续诱导培养72小时,每24小时补加甲醇使其质量分数保持在1.0%~1.5%。

7.根据权利要求5或6所述的制备蛋白的方法,其特征在于:在步骤S3之后,还包括如下步骤:

S4:将所述上清液利用Tris碱调节pH至7.5~8.5,以大于或等于15000g的转速离心10~20分钟,将获得的上清液加入到经pH 8Tris-HCl缓冲液平衡后的镍亲合层析柱中,用2~4倍层析柱体积的pH 8的含10mM Tris-HCl和30mM~50mM咪唑的缓冲液漂洗所述镍亲合层析柱;

S5:用含10mM Tris-HCl和100mM~400mM咪唑的缓冲液洗脱所述镍亲合层析柱,将得到的洗脱液利用分子量为3kDa的透析袋于10mM Tris-HCl缓冲液中透析,然后超滤浓缩。

8.根据权利要求7所述的制备蛋白的方法,其特征在于:在步骤S5之后,还包括如下步骤:

S6:将所述超滤浓缩得到的产品在-80℃下速冻,然后冷冻干燥。

9.根据权利要求5-8任一项所述的制备蛋白的方法制备得到的蛋白。

10.权利要求2、3或9所述蛋白、权利要求1所述基因或权利要求4所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在抗虫领域中的应用。

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