本发明属于微生物工程领域，涉及一种乳杆菌，具体涉及一种具有抗氧化功能的高加索酸奶乳杆菌jmcc0101，同时，本发明还涉及该乳杆菌的筛选方法及应用。
背景技术：
目前我国规定可用于食品的益生菌仅有双歧杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌干酪亚种、嗜热链球菌。开菲尔发酵乳具有众多的益生功能，开菲尔粒含多种生理性有益菌，黏附定植于肠道中与病原菌竞争黏附位点、营养物质，代谢产物乳酸、醋酸降低肠道ph值；产生的抑菌物质过氧化氢、细菌素等。作为开菲尔发酵乳中的微生物成份，高加索酸奶乳杆菌具有很好的作为益生菌的潜力，由于具有益生功能的开菲尔发酵乳由于其生产步骤繁琐、易导致污染且生产批次间差异较大。因此开发一株具有良好益生特性的菌株有着非常重要的现实意义。研究表明，氧化反应是人体衰老机能衰退的一大诱因，因此开发一款具有能够抗氧化能力的益生菌是具有重要意义的。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一株高加索酸奶乳杆菌jmcc0101，该菌株是从我国云南大理传统发酵乳制品中分离筛选而来，是一株具有很好的耐酸耐胆盐特性、抗氧化能力、良好的存活性能、弱后酸和发酵风味的菌株。
本发明的高加索酸奶乳杆菌jmcc0101，已于2015年12月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：cgmccno.11772，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明的另一个目的是提供高加索酸奶乳杆菌jmcc0101的筛选方法，依次通过样品的采集、富集、分离、纯化、鉴定、保存等实验，最终筛选出高加索酸奶乳杆菌jmcc0101。
本发明还有一个目的是提供了高加索酸奶乳杆菌jmcc0101的应用，高加索酸奶乳杆菌jmcc0101应用于制备益生菌菌粉或乳酸菌饮料。
为实现上述发明目的，本发明所采取的技术方案是：
一种高加索酸奶乳杆菌(lactobacilluskefiri)jmcc0101，它是从我国云南大理传统发酵乳制品中分离筛选出来的益生菌，该菌菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：cgmccno.11772。
进一步的，其16srrna的基因序列如下：
ccatctcctgatcaccttagacggctggtccccgaaggttacctcaccggctttgggtgttacaaactctcatggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgtggcatgctgatccacgattactagcgattccaacttcatgcaggcgagttgcagcctgcaatccgaactgagaacggctttaagagattagcttgacctcgcggtttcgcgactcgttgtaccgtccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtcttgctagagtgcccaactgaatgctggcaactaacaataagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcattctgtccccgaagggaacgcctaatctcttaggttggcagaagatgtcaagaccctggtaagggttcttcgcgtagcatcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcaaccttgcggtcgatctccccaggcggagtgcttaatgcgttagctgcagcactgaagggcggaaaccctccaacacttagcactcatcgtttacggcatggactaccagggtatctaatcctgttcgctacccatgctttcgagcctcagcgtcagttacagaccagacagccgccttcgccactggtgttcttccatatatctacgcatttcaccgctacacatggagttccactgtcctcttctgcactcaagtctcctggtttccgatgcacttctccggttaagccgaaggctttcacatcagacctaagaaaccgcctgcgctcgctttacgcccaataaatccggacaacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtggctttctggttggataccgtcaagatgtcaacagttactctgacacctgttcttctccaacaacagagttttacgagccgaaacccttcatcactcacgcggcgttgctccatcagactttcgtccattgtgggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtttgggccgtgtctcagtcccaatgtggccgattaccctctcaggtcggctacgtatcattgccttggtaggccattaccttaccaacaagctaatacgccgcgggtccatcctaaagtgatagccgaagccatcttttaaaccaaaaccatgtggttttggttgttatacggtattagcacctgtttccaagtgttatcccctacttcaagggcaggttacccacgtgttactcaccagttcgccactcgtttcgtgttaaatcatttaaatgcaagcatctaaaatcaataacggaaacgcgttcgacttgcatgtatagcacgccgcacagtca。
进一步的，其phes的基因序列如下：
caaacctcaccaatgcaggctcgtactttggaaaagcatgatttctcaaagggacctttgaagatgatctcaccaggaatcgtttaccgtcgtgatactgatgatccaacccattcacatcaattccatcaggttgaaggactctttattgatgagcacgtgacaatggctgatttaaagggaactttgattaccatggctcaaaacatttttggcaataaatttgatattcgtttacgaccaagttatttcccatttaccgaaccttctgttgaagtggatgttacctgctttaactgtatgggaaagggttgtgacgtctgcaaacataccggctggattgaagtcttaggtgccggcatggttcatcctaatgtgctcgatatggctggcgttgattcaaagaagtatggcg。
本发明的所述的高加索酸奶乳杆菌jmcc0101的筛选方法，按以下步骤顺序进行：
①样品采集
取25ml云南大理传统的发酵乳制品，加入到250ml生理盐水中，充分混匀，得到样品；
②样品的富集
取样品2ml，加入到100ml的lc液体培养基中，35℃培养72h，得到培养液；
③菌株的分离、纯化；
a、菌株分离
取培养液1ml，用0.9％(重量与体积的百分比)无菌的生理盐水稀释100000倍，分别为梯度稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍，得到菌悬液；
取mrs琼脂培养基，融化后，倒入培养皿，待其冷却、完全凝固后，吸取0.1ml菌悬液涂布到培养基上；
置35℃环境下厌氧培养72h(h2：co2：n2＝5：10：85)，观察菌落生长情况；
待平板出现典型菌落后，挑选出相应的菌落，进行下一步的菌株纯化；
b、菌株的纯化
挑取选中的单菌落，将菌落培养物划线接种到mrs琼脂培养基上，35℃有氧环境培养72h；然后，再将培养皿上长出的单菌落，继续划线接种到mrs琼脂培养基上，35℃有氧环境培养72h；连续培养三次；
④菌株的鉴定
将上述菌株进行革兰氏染色、显微镜下观察为革兰氏阳性、杆状菌株，然后通过dna提取、pcr扩增，16srrna基因序列，phes基因序列等实验数据综合分析，鉴定结果为高加索酸奶乳杆菌；
⑤菌株的保存
将菌落培养物置于无菌的20％甘油中在-70℃保存，同时接种mrs琼脂培养基试管斜面用于临时保存。
进一步的，步骤②中lc液体培养基由以下成分组成：
蛋白胨：10g，酵母膏：1g，牛肉膏：4g，k2hpo4：2g，乙酸钠：3g，柠檬酸铵：1g，mgso4·7h2o：0.2g，mnso4·7h2o：0.05g，干酪素酸性水解物：1g，吐温-80：1g，蒸馏水：1000ml；
该培养基调节ph6.0±0.1。
进一步的，步骤③中mrs琼脂培养基由以下成分组成：
酪蛋白胨：10g；牛肉膏：10g；酵母膏：5g；葡萄糖：20g；乙酸钠：5g；柠檬酸二胺：2g；吐温-80：1g；k2hpo4：2g；mgso4·7h2o：0.2g；mnso4·7h2o：0.05g；琼脂：15g；蒸馏水：1000ml；
该培养基调节ph6.8±0.1。
本发明采用的菌株具有很好的抗氧化作用，因此具有很好的抗衰老的作用。
所述高加索酸奶乳杆菌jmcc0101应用于制备益生菌菌粉或乳酸菌饮料。
进一步的，上述的益生菌菌粉由以下重量百分含量的原料制成：
高加索酸奶乳杆菌jmcc01012％-4％，植物乳杆菌2％-4％、嗜酸乳杆菌0.5％-1.5％、乳双歧杆菌0.5％-1.5％、干酪乳杆菌1％-2％，低聚果糖70％-90％、草莓提取物9％-11％。
进一步的，上述的乳酸菌饮料由以下重量份数的原料制成：
纯牛奶40-60份，水20-40份，蔗糖3-6份，105-107cfu/ml的高加索酸奶乳杆菌jmcc0101，105-107cfu/mlcfu/ml的副干酪乳杆菌，105-107cfu/mlcfu/ml的嗜热链球菌。
具体实施方式
实施例1高加索酸奶乳杆菌jmcc0101及其筛选方法
一种高加索酸奶乳杆菌(lactobacilluskefiri)jmcc0101，它是从我国云南大理传统发酵乳制品中分离筛选出来的益生菌，该菌菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：cgmccno.11772。
所述的高加索酸奶乳杆菌jmcc0101的筛选方法，按以下步骤顺序进行：
①样品采集
取25ml云南大理传统的发酵乳制品，加入到250ml生理盐水中，充分混匀，得到样品；
②样品的富集
取样品2ml，加入到100ml的lc液体培养基中，35℃培养72h，得到培养液；
③菌株的分离、纯化；
a、菌株分离
取培养液1ml，用0.9％(重量与体积的百分比)无菌的生理盐水稀释100000倍，分别为梯度稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍，得到菌悬液；
取mrs琼脂培养基，融化后，倒入培养皿，待其冷却、完全凝固后，吸取0.1ml菌悬液涂布到培养基上；
置35℃环境下厌氧培养72h(h2：co2：n2＝5：10：85)，观察菌落生长情况；
待平板出现典型菌落后，挑选出相应的菌落，进行下一步的菌株纯化；
b、菌株的纯化
挑取选中的单菌落，将菌落培养物划线接种到mrs琼脂培养基上，35℃有氧环境培养72h；然后，再将培养皿上长出的单菌落，继续划线接种到mrs琼脂培养基上，35℃有氧环境培养72h；连续培养三次；
④菌株的鉴定
将上述菌株进行革兰氏染色、显微镜下观察为革兰氏阳性、杆状菌株，然后通过dna提取、pcr扩增，16srrna基因序列，phes基因序列等实验数据综合分析，鉴定结果为高加索酸奶乳杆菌；
其16srrna的基因序列如下：
ccatctcctgatcaccttagacggctggtccccgaaggttacctcaccggctttgggtgttacaaactctcatggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgtggcatgctgatccacgattactagcgattccaacttcatgcaggcgagttgcagcctgcaatccgaactgagaacggctttaagagattagcttgacctcgcggtttcgcgactcgttgtaccgtccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtcttgctagagtgcccaactgaatgctggcaactaacaataagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcattctgtccccgaagggaacgcctaatctcttaggttggcagaagatgtcaagaccctggtaagggttcttcgcgtagcatcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcaaccttgcggtcgatctccccaggcggagtgcttaatgcgttagctgcagcactgaagggcggaaaccctccaacacttagcactcatcgtttacggcatggactaccagggtatctaatcctgttcgctacccatgctttcgagcctcagcgtcagttacagaccagacagccgccttcgccactggtgttcttccatatatctacgcatttcaccgctacacatggagttccactgtcctcttctgcactcaagtctcctggtttccgatgcacttctccggttaagccgaaggctttcacatcagacctaagaaaccgcctgcgctcgctttacgcccaataaatccggacaacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtggctttctggttggataccgtcaagatgtcaacagttactctgacacctgttcttctccaacaacagagttttacgagccgaaacccttcatcactcacgcggcgttgctccatcagactttcgtccattgtgggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtttgggccgtgtctcagtcccaatgtggccgattaccctctcaggtcggctacgtatcattgccttggtaggccattaccttaccaacaagctaatacgccgcgggtccatcctaaagtgatagccgaagccatcttttaaaccaaaaccatgtggttttggttgttatacggtattagcacctgtttccaagtgttatcccctacttcaagggcaggttacccacgtgttactcaccagttcgccactcgtttcgtgttaaatcatttaaatgcaagcatctaaaatcaataacggaaacgcgttcgacttgcatgtatagcacgccgcacagtca。
其phes的基因序列如下：
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⑤菌株的保存
将菌落培养物置于无菌的20％甘油中在-70℃保存，同时接种mrs琼脂培养基试管斜面用于临时保存。
所述的高加索酸奶乳杆菌jmcc0101的筛选方法，步骤②中lc液体培养基由以下成分组成：
蛋白胨：10g，酵母膏：1g，牛肉膏：4g，k2hpo4：2g，乙酸钠：3g，柠檬酸铵：1g，mgso4·7h2o：0.2g，mnso4·7h2o：0.05g，干酪素酸性水解物：1g，吐温-80：1g，蒸馏水：1000ml；
该培养基调节ph6.0±0.1。
所述的高加索酸奶乳杆菌jmcc0101的筛选方法，步骤③中mrs琼脂培养基由以下成分组成：
酪蛋白胨：10g；牛肉膏：10g；酵母膏：5g；葡萄糖：20g；乙酸钠：5g；柠檬酸二胺：2g；吐温-80：1g；k2hpo4：2g；mgso4·7h2o：0.2g；mnso4·7h2o：0.05g；琼脂：15g；蒸馏水：1000ml；
该培养基调节ph6.8±0.1。
本发明高加索酸奶乳杆菌jmcc0101的生物学特性如下：
1、细胞形态和理化实验结果
高加索酸奶乳杆菌jmcc0101的细胞形态和理化实验结果如下表1所示：
表1jmcc0101的细胞形态和理化实验结果
由表1可知，高加索酸奶乳杆菌jmcc0101为革兰氏染色阳性、杆状、接触酶和氧化酶实验阴性的菌株。碳水化合物产酸特性中，“+”表示发酵利用，“－”表示不发酵利用。
2、抗生素敏感实验结果
表2jmcc0101的抗生素敏感实验结果
测定了高加索酸奶乳杆菌jmcc0101对30种抗生素的敏感性，由表2可知，该菌种对测试的27种抗生素敏感。
3、耐酸耐胆盐特性实验
将高加索酸奶乳杆菌jmcc0101和本实验室保存的其他乳杆菌(kd18，kd33，kl01，ku15，kl07，kl24，kl22，kl03)分别挑取1接种环纯化菌株接种到mrs培养基中，37℃培养48h，取出计数；同时，各取1ml该培养基，分别加入到ph为2.5的磷酸盐缓冲液和3‰含牛胆盐的mrs培养溶液中37℃孵育，于0h、3h进行菌数的测定，并计算其存活率。
表3耐酸耐胆盐特性实验数据
4、活菌数测试和后酸测试
将高加索酸奶乳杆菌jmcc0101、ku15、kl22三株菌在mrs液体培养基活化后3％接种量至脱脂奶中放置于37℃，每周测试活菌数、酸度。最终，在四周的测试中，jmcc0101和ku15活菌数始终保持在1×107cfu/ml以上同时酸度均在60t°以内。
表4活菌数数据
表5酸度数据
5、发酵风味实验
a)使用10％脱脂奶，不加糖的情况下，jmcc0101、ku15、kl22三株菌以2％的接种量分别与基础发酵剂1213(丹尼斯克公司提供，添加量为0.07g/kg)混合发酵5小时，同时设置只有基础菌的对照组，ph达到4.4左右停止发酵搅拌后4℃放置，24小时后选则专业的感官评鉴人员品尝进行排序和描述。结果口味由好到坏依次为jmcc0101＝kl22＞ku15＞空白。
b)纯牛奶加如7％的糖为基料进行重复a试验，为使3株乳杆菌风味散发采用长时间发酵的基础发酵剂1209(丹尼斯克公司提供，添加量0.07g/kg)，发酵20小时后，搅拌放于4℃，24小时后品评。结果口味由好到坏依次为jmcc0101>ku15>kl22>空白。
6、抗氧化能力实验
活化菌株，在mrs液体培养基，37℃培养传代3次后，接种于mrs液体培养基中，37℃培养16h，收集菌液于4000rpm，4℃离心10min，收集菌体，生理盐水洗涤1次。用生理盐水将细胞浓度调整至1×108cfu/ml，备用；
a)羟自由基清除能力检测(fenton法)
在10ml试管中依次加入1ml5mmol/l水杨酸-乙醇溶液，1ml5mmol/l硫酸亚铁，1ml3mmol/l过氧化氢和不同菌液混合均匀。用双蒸水补足10ml，37℃水浴15min，于4℃、6000rpm离心10min，取上清液在510nm处测定吸光度(以双蒸水为参比)。
ho·清除率(％)＝[(ao-as)/ao]×100％
ao为无样品的od值；as为有样品的od值。
b)超氧阴离子清除能力检测(邻苯酚自氧化法)
在不同菌液样品中加入4.5mltris-hcl(ph8.2150mmol/l)，25℃水浴20min，加入0.4ml1.2mmol/l邻苯三酚，25℃水浴5min，立即加入2滴8mol/lhcl终止反应。取上清液在325nm处测定吸光度(以双蒸水为参比)。
o2—清除率(％)＝[1-(ao/as)]×100％
ao为无样品的od值；as为有样品的od值。
c)dpph清除能力检测
在不同菌液样品中加入1ml0.2mmol/ldpph·无水乙醇溶液，混匀后在室温下避光反应30min，并在6000rpm离心10min，取上清液在517nm处测定吸光度(以等体积蒸馏水和无水乙醇混合液为参比)。空白组以等体积无水乙醇代替dpph溶液，对照组以等体积蒸馏水代替样品溶液。
清除率＝[1-(as-aj)/ao]×100％
ao为对照品的od值；as为有样品的od值；aj为空白组的od值。
表6抗氧化性能测试数据
实施例2含高加索酸奶乳杆菌jmcc0101的益生菌菌粉的制备
原料组成：高加索酸奶乳杆菌jmcc01013％，植物乳杆菌3％、嗜酸乳杆菌1％、乳双歧杆菌1％、干酪乳杆菌2％，低聚果糖80％、草莓提取物10％；该益生菌菌粉制备工艺为：按配方比例称取菌粉、低聚果糖、草莓提取物进行混合，在真空分装机上进行分装，2g/袋，贴标入库，冷藏保存。
制备得到的益生菌粉具有抗氧化功能且产品中活性乳酸菌总数≥4×1010cfu/袋。
实施例3含高加索酸奶乳杆菌jmcc0101的乳酸菌饮料的制备
将纯牛奶50份，水30份，蔗糖5份混合均匀于110℃下灭菌15min制备培养基液；
将106cfu/ml的高加索酸奶乳杆菌jmcc0101、106cfu/ml的副干酪乳杆菌和106cfu/ml的嗜热链球菌接入培养基液中混匀，37℃发酵至ph至4.2-4.6，终止发酵，冷却灌装，冷藏保存。
制备得到的含高加索酸奶乳杆菌jmcc0101的乳酸菌饮料具有抗氧化功能。
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