一株二苯醚降解菌及其应用的制作方法

技术领域：

本发明属于生物技术领域，涉及一株二苯醚降解菌及其应用。

背景技术：

二苯醚为无色结晶或液体，有天竺葵气味。能够溶于乙醇、苯、乙醚和冰乙酸，但不溶于水。二苯醚相对密度为1.075，熔点和沸点分别为28℃和259℃。半数致死量(大鼠，经口)为3370mg/kg，低毒。

由于二苯醚对碱性较为稳定，因此多用于调配皂用香精，也常用作香叶油的代用品，适于调制花香型化妆品、除臭剂等。同时，在农药合成领域中，二苯醚是一类非常重要的杀虫剂及除草剂合成前体。在工业中，二苯醚也可以用来作为热导媒介的成分、溶剂以及塑化剂。

工业上常用的二苯醚衍生化合物(二苯醚类化合物)主要包括卤代二苯醚(多溴代二苯醚、多氯代二苯醚和多氟代二苯醚)、苯氧基苯甲酸(pba)、拟除虫菊酯类杀虫剂和二苯醚类除草剂等。其中，多氯代二苯醚作为阻燃剂及除草剂被大量生产使用。

减少农药和污染物的使用以及去除农药污染物残留是减轻农药危害的有效途径。二苯醚类除草剂的消除方法有很多，包括物理、化学和生物方法。同物理化学方法相比，生物修复具有可基本保持土壤理化特性，污染物降解完全、处理成本低和应用广泛的特点。农药残留微生物降解技术是通过在土壤中接种高效降解性微生物，原位消除土壤中的农药残留，降低土壤中农药污染物的含量，从而减少进入作物体内的农药。本技术投入低、效率高，已经在无公害农产品中得到应用，是一项已经获得农民认可的、可操作性强的无公害农产品生产技术。应用微生物或无细胞制品来削减农药污染的生物修复技术显示出广阔的应用前景。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一株二苯醚降解菌。

本发明的另一目的是提供该菌株的应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一株二苯醚降解菌sc_4，分类命名为鞘氨醇单胞菌(sphingobiumphenoxybenzoativorans),于2016年12月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:m2016776。

该降解菌(sc_4)经形态、生理生化特征分析和16srrna基因序列同源性分析，鉴定为鞘氨醇单胞菌属中的sphingobiumdiphenylethervorans，菌株sc_4一株在ph7.0至8.0、温度30至35℃生长良好，能以二苯醚为唯一碳源生长。

采用液相色谱法测定菌株sc_4对二苯醚的降解率，30℃培养三天后对100mg.l^-1浓度的二苯醚的降解率达到95％。采用hplc-ms技术分析菌株sc_4降解二苯醚的中间产物。结果表明：主要代谢中间产物为2,4-己二烯酸苯酚酯和苯酚，其中2,4-己二烯酸苯酚酯是新发现的纯培养微生物降解二苯醚的中间产物。

该菌株的特征：细胞呈短杆状，好氧，革兰氏染色阴性，有鞭毛，能通过极生鞭毛运动。在r2a培养基上生长3天后，菌落呈黄色，边缘光滑，菌落凸起。在nacl浓度为0-0.5％，温度15-40℃及ph6.0-9.0范围内都能生长。

氧化酶和过氧化氢酶呈阳性。能够水解七叶苷、酪蛋白，能同化葡萄糖；不产吲哚，不能进行硝酸盐还原。能够发酵葡萄糖，β半乳糖苷酶，明胶，尿素，次黄嘌呤，淀粉和酪氨酸水解为阴性；不能同化阿拉伯糖，甘露糖，甘露醇，n-乙酰葡糖胺，d-麦芽糖，葡萄糖酸钾，柠檬酸三钠，苹果酸和己二酸。

在用apizym试剂盒检测时，碱性磷酸酶，c4酯酶，c8类脂质酶，亮氨酸芳胺酶，缬氨酸芳胺酶，胱氨酸芳胺酶，酸性磷酸酶，萘酚-as-bi-磷酸水解酶，β葡糖苷酸酶，α-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖苷酶为阳性，而c14脂肪酶，胰蛋白酶，α-chymotrypsine，α-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶，n-乙酰基-葡糖胺和α甘露糖苷酶呈阴性。

在用api50chb试剂盒检测时，只能利用半乳糖，葡萄糖，熊果苷，蔗糖，海藻糖，淀粉，d-棉子糖和龙胆酸。

对青霉素g、链霉素和氨苄青霉素有抗性，对红霉素、庆大霉素、氯霉素、罗红霉素、羧苄青霉素、万古霉素、阿莫西林、头孢哌酮、利福平、卡那霉素、四环霉素和多粘菌素b敏感。

细胞非羟基脂肪酸成分主要有c18:1ω7c/c18:1ω6c(59.9％),c16:1ω7c/c16:1ω6c(13.8％),c16:0(6.5％)和c17:1ω6c(5.1％)；最主要的羟基脂肪酸成分为c14:02-oh(6.84％)。主要呼吸醌为q10，dnag+cmol％含量为62.9％。

对该菌降解二苯醚的代谢产物进行了hplc-ms检测，发现其主要的降解中间产物是2,4-己二烯酸苯酚酯和苯酚，说明二苯醚在菌株sc_4的作用下可通过双加氧反应首先降解为2,4-己二烯酸苯酚酯，随后再经水解作用生成苯酚，目前该途径尚未在能够降解二苯醚的纯培养微生物中被发现和报道，其发现对于实现二苯醚的定向高效降解具有重要的意义，具备潜在的应用前景。

本发明所述的降解菌sc_4在降解二苯醚中的应用。

本发明所述的降解菌sc_4在受二苯醚污染的水体、土壤或农产品的生物净化中的应用。

本发明所述的降解菌sc_4在制备二苯醚降解菌剂中的应用。

有益效果：

(1)该菌能够以二苯醚为唯一碳源进行降解，前人的报道需要外加碳源才能实现降解菌对二苯醚的降解；(2)该菌对二苯醚具有高效降解能力，在无机盐液体培养基中对二苯醚的降解能力可达到95％；(3)该菌可通过双加氧作用断裂二苯醚的c-c键，第一次检测到产物2,4-己二烯酸苯酚酯，可利用该菌的降解酶及强化工程菌株实现二苯醚的定向降解。该菌株可降解除草剂二苯醚，可用于受二苯醚污染的水体、土壤或农产品的生物净化。

附图说明

图1菌株sc_4菌落照片

图2接种量对二苯醚降解效率的影响

图3温度对二苯醚降解效率的影响

图4ph对二苯醚降解效率的影响

图5液相色谱检测二苯醚的降解效果

a:二苯醚降解液相图谱；b:二苯醚降解产物苯酚质谱图；c：二苯醚降解产物2,4-己二烯酸苯酚酯质谱图。

图6菌株sc_4对二苯醚的微生物降解途径

生物材料保藏信息

sc_4，分类命名为sphingobiumdiphenylethervoranssc_4，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学,保藏日期为2016年12月21日,保藏编号为cctccno:m2016776。

具体实施方式

以下实施例中涉及的培养基配方如下:

所述的无机盐培养基的组分及配比为：nh4no31.5g，kh2po40.5g，k2hpo41.5g，nacl0.5g，mgso4·7h2o0.2g，用蒸馏水定容至1,000ml，ph7.0，固体添加琼脂粉12g。

所述的r2a培养基的组分及配比为：葡萄糖0.5g，可溶性淀粉0.5g，酪蛋白0.5g，酵母浸出物0.5g，胰蛋白胨0.5g，mgso4·7h2o0.05g，kh2po40.3g,用蒸馏水定容1,000ml，调节ph为7.2，固体添加琼脂粉12g。

实施例1菌株sc_4的分离筛选

采集江苏省南京市某农药厂受除草剂二苯醚严重污染的土壤，取污染土样1.0g接种至二苯醚浓度为100mg·l^-1100mlmsm培养基中，30℃、150rpm摇床培养7天后将2ml富集液转接至新鲜的msm培养基中。经过连续五次传代培养，第六代富集培养液用紫外扫描仪法和高效液相色谱法同时测定二苯醚的含量，发现二苯醚降解率达90％。将第六代富集液进行梯度稀释后，涂布在含100mg·l^-1二苯醚的r2a琼脂培养基平板上，30℃培养3天，挑取单菌落培养后接种菌悬液至含二苯醚的无机盐液体培养基中验证菌株对二苯醚的降解效果，将其中降解效率最高的一株2016年12月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:m2016776。其菌落照片见图1，鉴定为鞘氨醇单胞菌(sphingobiumdiphenylethervorans),命名为sc_4。该菌在实验室条件下对100mg/l二苯醚降解率为95％。

实施例2：实验室降解试验

1接种量对二苯醚降解效率的影响

将菌株sc_4接种到液体r2a中，30℃，180rpm培养至对数中期，6,000g离心10min收集菌体，按1％、2％、5％、10％和20％接种量接种后分别加入二苯醚使其终浓度为100mg·l^-1，30℃、180rpm，从0h起每隔8h取样一直取至48h，hplc测定各样品二苯醚的浓度。测定结果表明(图2)，随着接种量的增大，菌株sc_4对二苯醚的降解率也在增加，当接种量为20％时，菌株sc_4能在24小时内将100mg·l^-1的二苯醚完全降解。

2温度对二苯醚降解效率的影响

将菌株sc_4接种到100ml液体r2a培养基中，30℃，180rpm培养至对数中期，6,000g离心10min收集菌体，用20mlmsm液体培养基重悬菌体。配制二苯醚终浓度为100mg·l^-1的100mlmsm培养基，按5％接种量接种重悬的sc_4细胞，随后分别置于15、20、25、30、35和40℃的温度下摇床180rpm培养72h，用hplc测定各样品二苯醚的浓度。

如图3所示，在15℃到30℃范围内，随着温度的升高，sc_4对二苯醚的降解率逐步提升，在30℃时降解率达到最高。而当温度超过30℃后，sc_4对二苯醚的降解率随着温度升高而降低。温度到达40℃时降解率已低于40％。

3ph对二苯醚降解效率的影响

将菌株sc_4接种到液体r2a培养基中30℃，180rpm培养至对数中期，6,000g离心10min收集菌体，用msm重悬菌体，随后按照5％接种量接种至ph值分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0的二苯醚终浓度为100mg·l^-1的msm液体培养基，30℃、180rpm培养72h，用hplc测定各样品二苯醚的浓度。

如图4所示，当ph值在6.0-8.0范围内，sc_4对二苯醚的降解率较高(降解率均高于70％)，并且在ph7.0时降解率达到最高(95％)。然而当ph低于6.0或者高于8.0时，sc_4对二苯醚的降解率均很低(降解率低于30％)。特别是ph为3.0或10.0时，sc_4对二苯醚失去降解性。

4菌株sc_4以二苯醚为碳源生长以及对二苯醚的降解作用

将2ml的sc_4菌悬液接入到含100mg.l^-1二苯醚的100ml无机盐液体培养基中，设三次重复，以不接种细菌但含相同浓度二苯醚的无机盐液体培养基为对照。30℃，180转/分振荡培养，分别培养12,24,48,72小时，液相色谱法检测二苯醚的含量。结果表明：接种sc_4后二苯醚在培养基中的残留逐渐减少，72小时残留量仅为4mg.l^-1，说明sc_4菌株对二苯醚的降解率达到95％以上。

4菌株sc_4对二苯醚的微生物降解途径鉴定

将制备好的sc_4细胞菌悬液按10％的接种量接种至二苯醚终浓度为100mg·l^-1的100ml的msm液体培养基中，于30℃、180rpm的摇床中振荡培养。

二苯醚降解液样品的制备：每隔4小时取样3ml至10ml试管中，向样品中加入等体积的三氯甲烷，剧烈振荡10min，静置分层后将水相去除，剩余有机相用0.22μm有机滤膜过滤后装至干净的离心管中，通风橱中吹干后用等体积甲醇重新溶解。随后将样品保存至4℃冰箱。

对定时取样的样品进行hplc检测发现，样品hplc图谱中发现2个峰，菌株sc_4对二苯醚降解的hplc检测结果如图5(a)所示。产物1的出峰时间与苯酚标样液相时间一致，且其质谱碎片与苯酚标样吻合(图5b)；产物2无标样，但通过二级质谱碎片分析我们确定其为2,4-己二烯酸苯酚酯。

我们推断出了sc_4对二苯醚的降解途径如图6所示：二苯醚首先在链接氧的碳原子及其邻位的碳原子通过双加氧形成2,4-己二烯酸苯酚酯，随后酯键水解生成苯酚和粘康酸半醛。