一株降解除草剂乙草胺和杂草焚的细菌的制作方法

技术领域：
本发明涉及微生物领域中一株降解除草剂乙草胺和杂草焚的细菌。
背景技术：
：乙草胺，英文通用名称acetochlor，化学名称是2-乙基-6甲基-N-乙氧基甲基-α-氯代乙酰替苯胺。乙草胺是内吸性酰胺类除草剂，是选择性的芽前除草剂。能被杂草的幼芽和幼根吸收，抑制杂草蛋白质合成，而使杂草死亡。主要用于大豆、花生、玉米、棉花等作物防除一年生禾本科杂草和部分阔叶杂草，对大豆菟丝子有良好防效，对多年生杂草无效。杂草焚，又名三氟羧草醚，英文名称acifluorfen，化学名称5-(2-氯-α，α，α-三氟对甲苯氧基)2-硝基苯甲酸。杂草焚是二苯醚类除草剂，属接触性除草剂，是原卟啉氧化酶抑制剂。通常采用25％水剂进行大豆苗前表土处理及苗后经叶喷雾，可有效防除大豆田阔叶杂草如苍耳、苘麻、龙葵、苋、藜、蓼、牵牛、豚草、曼陀罗、马齿苋、铁苋菜、鬼针草、鼬瓣花、鸭跖草等，苗后早期处理也可防除包括狗尾草在内的一年生禾本科杂草。喷药后，大豆会不同程度受害，表现为叶片黄化、皱缩、褐变等，但6～7d后恢复正常。乙草胺和杂草焚半衰期较短，一直被认为是一种低毒的环境友好型农药，但近年来频繁、过量或使用不当，对农田土壤和地下水等造成了不同程度的污染，对后茬作物的危害也越来越严重。研究表明，在环境中大量施用乙草胺和杂草焚造成一定的残留毒性，其在地下水、地表水中可以残留数年，进入到环境中通过食物链在生物体内不断富集，对鱼类有较强的毒性，对环境污染很大。尤其乙草胺可以引起生物体的内分泌紊乱，造成不育、不正常的性别差异甚至致癌，已被美国环保局定为致癌物。自然界除草剂残留的降解主要依靠土壤中微生物来完成，但自然降解十分缓慢。因此，有针对性地筛选高效微生物菌株，研制微生物修复剂，通过人工接种加速土壤除草剂残留的降解消除农田除草剂残留药害是一项十分必要的工作和切实可行的途径。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是如何降解除草剂乙草胺和杂草焚。为解决上述技术问题，本发明提供了一株可以降解除草剂乙草胺和杂草焚的细菌。本发明提供的细菌是根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47，该菌株已于2014年10月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCCNo.9867。本发明的另一个目的是提供一种菌剂，该菌剂的活性成分为所述的根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47CGMCCNo.9867。上述菌剂可为下述1)或2)所述菌剂：1)用于降解除草剂乙草胺和/或杂草焚的菌剂；2)用于修复土壤除草剂乙草胺和/或杂草焚污染的菌剂。所述菌剂还可以包括载体。所述载体可为固体载体或液体载体。所述固体载体可为矿物材料、植物材料或高分子化合物；所述矿物材料可为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述植物材料可为玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一种；所述高分子化合物可为聚乙烯醇和/或聚二醇。所述液体载体可为有机溶剂、植物油、矿物油或水；所述有机溶剂可为癸烷和/或十二烷。所述菌剂中，所述活性成分可以以被培养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。所述组合物的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。根据需要，所述菌剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、pH调节剂等。所述的根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47CGMCCNo.9867或以根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47CGMCCNo.9867为活性成分的菌剂在降解除草剂乙草胺和/或杂草焚中的应用也属于本发明的保护范围。所述的根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47CGMCCNo.9867或以根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47CGMCCNo.9867为活性成分的菌剂在修复土壤除草剂乙草胺和/或杂草焚污染中的应用也属于本发明的保护范围。本发明的再一个目的是提供一种培养根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47CGMCCNo.9867的方法。本发明所提供的培养根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47CGMCCNo.9867的方法，包括将根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47CGMCCNo.9867在用于培养根瘤菌的培养基中培养的步骤。本发明的又一个目的是提供一种以根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47CGMCCNo.9867为活性成分的菌剂的制备方法。本发明所提供上述菌剂的制备方法，包括如下步骤：将所述的根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47CGMCCNo.9867作为活性成分，得到所述菌剂。本发明是从长期受到除草剂污染的农田采集土样，并从中分离筛选得到的除草剂乙草胺和/或杂草焚降解菌根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47CGMCCNo.9867。实验证明，该菌株在无机盐培养基中7天对50mg/L乙草胺降解率达到73.65％；对100mg/L杂草焚的降解率达到9.04％。这表明该菌株能降解除草剂乙草胺和/或杂草焚，在修复土壤除草剂乙草胺和杂草焚污染方面具有广阔的应用前景。保藏说明菌种名称：根瘤菌拉丁名：(Rhizobiumsp.)菌株编号：198-R-47保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏机构简称：CGMCC地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号保藏日期：2014年10月28日保藏中心登记入册编号：CGMCCNo.9867附图说明图1为乙草胺标准曲线。图2为杂草焚标准曲线。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中所用的培养基如下：无氮液体培养基：溶质及其浓度为蔗糖10g/L，NaCl0.12g/L，K2HPO4·3H2O0.5g/L，CaCO31g/L，MgSO4·7H2O0.2g/L；溶剂为蒸馏水；pH7.2。无氮固体培养基：向无氮液体培养基中加琼脂至其含量为15-20g/L得到的培养基。牛肉膏蛋白胨液体培养基：溶质及其浓度为牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl5g/L；溶剂为蒸馏水；pH7.2。牛肉膏蛋白胨固体培养基：溶质及其浓度为牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl5g/L、琼脂15-20g/L；溶剂为蒸馏水；pH7.2。无机盐液体培养基：溶质及其浓度为NH4Cl1.0g/L，KH2PO40.5g/L，K2HPO41.5g/L，MgSO40.2g/L，NaCl0.5g/L；溶剂为蒸馏水；pH7.0。无机盐固体培养基：向无机盐液体培养基中加琼脂至其含量为2％得到的培养基。下述实施例中的根瘤菌(Rhizobiumsp.)LD1616CGMCCNo.7775(简称根瘤菌(Rhizobiumsp.)LD1616)已在中国发明专利文献CN103343100B中公开。实施例1、根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47CGMCCNo.9867的分离与鉴定一、乙草胺/杂草焚降解菌198-R-47的分离1、在100ml无菌水中加入10g土壤样品(采自中国黑龙江黑河受除草剂污染的农田)，振荡培养30min制成混浊液。吸取1ml上述混浊液加入盛有9ml无菌水中的试管中充分混匀(此时稀释度记为10-1)，然后从此试管中吸取1ml加入到另一盛有9ml无菌水的试管中混合均匀，以此类推制成10-2、10-3、10-4、10-5不同稀释度的菌悬液。将各稀释度取0.1ml均匀涂布在无氮固体培养基平板上，28℃恒温静置培养2—3天。待菌落形成后，在无氮固体培养基平板上进行菌种纯化。2、对除草剂乙草胺、杂草焚、普施特和氯嘧磺隆降解能力的初步筛选采用平板透明圈法。将乙草胺标准品(Fluka公司产品)加入无机盐固体培养基使其含量为1000mg/L，得到乙草胺平板；将杂草焚标准品(Fluka公司产品)加入无机盐固体培养基使其含量为1000mg/L，得到杂草焚平板；将普施特标准品(Fluka公司产品)加入无机盐固体培养基使其含量为1000mg/L，得到普施特平板；将氯嘧磺隆标准品(Fluka公司产品)加入无机盐固体培养基使其含量为1000mg/L，得到氯嘧磺隆平板。将乙草胺平板、杂草焚平板、普施特平板和氯嘧磺隆平板进行分区，吸取步骤1纯化得到的每株菌的菌悬液10μL和本实验室的根瘤菌(Rhizobiumsp.)LD1616的菌悬液10μL(各种菌株菌悬液的菌体含量相同)分别点种到四种平板上(每株菌在一个平板上重复3次)，28℃培养、观察。筛选到一株在乙草胺平板和杂草焚平板上均能形成较大透明圈的菌株，将该菌株其命名为乙草胺/杂草焚降解菌198-R-47。乙草胺/杂草焚降解菌198-R-47在普施特平板和氯嘧磺隆平板均不能形成透明圈。根瘤菌(Rhizobiumsp.)LD1616只在氯嘧磺隆平板上形成较大透明圈，在普施特平板、乙草胺平板和杂草焚平板上均不能形成透明圈。说明乙草胺/杂草焚降解菌198-R-47能降解乙草胺和杂草焚，不能降解氯嘧磺隆和普施特；根瘤菌(Rhizobiumsp.)LD1616能降解氯嘧磺隆，不能降解普施特、乙草胺和杂草焚。表1.乙草胺/杂草焚降解菌198-R-47和根瘤菌(Rhizobiumsp.)LD1616对四种除草剂降解能力初筛结果菌株编号普施特乙草胺氯嘧磺隆杂草焚乙草胺/杂草焚降解菌198-R-47－+－+根瘤菌(Rhizobiumsp.)LD1616－-+－注：“+”表示形成较大透明圈，“－”表示无透明圈形成。二、乙草胺/杂草焚降解菌198-R-47的鉴定从以下几个方面鉴定步骤一分离并纯化得到的乙草胺/杂草焚降解菌198-R-47：1、形态学鉴定将处于对数生长期且菌落大小稳定，上述步骤一分离并纯化得到的乙草胺/杂草焚降解菌198-R-47进行单菌落状态观察，主要包括菌落的大小、颜色、透明度、湿润度、菌落表面状态(是否平坦、突起、褶皱、凹陷等)、菌落边缘状态(是否整齐、不规则、放射状等)。结果表明，上述步骤一分离并纯化得到的乙草胺/杂草焚降解菌198-R-47菌落圆形凸起，乳白色，湿润不透亮，边缘规则，直径0.8-1.5mm。2、生理生化特征分析参考《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册.北京:科学出版社，2011.)和《微生物学实验》(沈萍,范秀容,李广武.微生物学实验(第三版).北京:高等教育出版社,1999.)测定上述乙草胺/杂草焚降解菌198-R-47的生理生化特征。所述乙草胺/杂草焚降解菌198-R-47的生理生化特征测定结果如表2所示：表2.乙草胺/杂草焚降解菌198-R-47的生理生化特征注：“+”表示阳性，“－”表示阴性。3、16SrDNA序列同源性分析常规方法培养上述步骤一分离纯化得到的乙草胺/杂草焚降解菌198-R-47，提取菌株的总DNA作为基因扩增模板，以细菌16SrDNA通用引物，27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492r：5′-TACCTTGTTACGACTT-3′进行PCR反应。反应体系采用上海生物工程有限公司PCR扩增试剂盒。反应程序为：95℃变性30s、55℃退火1min、72℃延伸2min，共30个循环。DNA测序由北京三博远志生物技术公司完成，序列拼接及相似性分析使用DNAStar软件完成，基因比对通过美国国家生物技术信息中心NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)和EzTaxon在线完成。PCR基因扩增得到乙草胺/杂草焚降解菌198-R-47的16SrDNA基因片段约1.3kb，测定序列后与NCBI和EzTaxon数据库中已公开的16SrDNA序列进行在线同源性比对，结果显示乙草胺/杂草焚降解菌198-R-47与根瘤菌属RhizobiumpusenseNRCPB10T同源性最高，达到99.31％。乙草胺/杂草焚降解菌198-R-47的16SrDNA序列详见序列1。鉴于上述形态、生理生化特征分析和16SrDNA序列同源性分析结果，将步骤一分离纯化得到的乙草胺/杂草焚降解菌198-R-47鉴定为根瘤菌属(Rhizobiumsp.)。该乙草胺/杂草焚降解菌198-R-47已于2014年10月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCCNo.9867。乙草胺/杂草焚降解菌198-R-47的全称为根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47CGMCCNo.9867，简称为根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47。实施例2、根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47CGMCCNo.9867降解乙草胺能力定量测定一、乙草胺测定标准曲线制作准确称取乙草胺标准品(Fluka公司产品)10.0mg于10mL容量瓶中，用少量甲醇溶解，将容量瓶放在超声波浴槽中振荡10min，然后用甲醇定容至10mL，摇匀，配成1000mg/L乙草胺母液。然后用甲醇稀释获得浓度分别为10、20、40、60、80、100mg/L标准溶液，采用高效液相色谱法(HPLC)测定不同浓度乙草胺标准品的峰面积，3次重复。以乙草胺的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制乙草胺标准曲线，如图1所示。检测条件如下：检测系统：Agilent1100Series。色谱柱：C18DiamosilTM反相柱，250mm×4.6mm，粒径5μm。色谱条件：流动相：甲醇：水＝80：20(v/v)，水用冰醋酸调至pH＝3；检测波长，215nm；流速，1.0mL/min；进样体积，20μL；柱温30℃。所得乙草胺测定标准曲线：y＝55.363x+144.5(R2＝0.9999)。其中，y为峰面积，x为乙草胺浓度。二、根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47CGMCCNo.9867降解乙草胺能力定量测定根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47处理：将根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47CGMCCNo.9867接种在牛肉膏蛋白胨固体培养基上培养24h，挑取1环接种在5mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，180r/min培养12h，离心去掉培养基，用无机盐液体培养基调节到OD600值为1.0。吸取0.2mL菌悬液(1×109cfu/ml)接种到5mL含乙草胺50mg/L的无机盐液体培养基(向无机盐液体培养基中加入乙草胺(Fluka公司产品)使乙草胺的浓度为50mg/L得到的培养基)的试管中，28℃，180r/min培养7天，得到降解液，按照如下方法测定乙草胺残留量：取3mL降解液至50mL离心管中，8000r/min离心5min收集上清液，加入3mL二氯甲烷，剧烈振荡5min，静置10min，待水相和有机相分层，加入少量无水硫酸钠对有机相进行脱水，准确吸取800μL有机相于1.5mL的离心管中，用氮吹仪吹干，加入400μL甲醇，在超声波清洗器中超声10min，用0.22μm的有机相针刺式滤器过滤至液相色谱样品瓶，按照上述HPLC法测定乙草胺。根瘤菌(Rhizobiumsp.)LD1616处理：除将上述根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47处理中的根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47CGMCCNo.9867替换为根瘤菌(Rhizobiumsp.)LD1616CGMCCNo.7775，其余均相同。空白对照处理：同时，以未接种根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47CGMCCNo.9867的上述含乙草胺50mg/L的无机盐培养基作为空白对照，按照上述方法测定乙草胺的浓度。乙草胺降解率：X＝(1-A/B)×100％，式中X为降解率(％)，A为根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47处理液中残留的乙草胺浓度或根瘤菌(Rhizobiumsp.)LD1616处理液中残留的乙草胺浓度，B为未接菌空白对照处理液中残留的乙草胺浓度。实验设3次重复，每次重复每个处理接种10个试管。表3.根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47CGMCCNo.9867降解乙草胺功效结果显示，乙草胺初始浓度为50mg/L，7天后所述根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47CGMCCNo.9867对乙草胺的降解率达到73.65％(如表3所示)；根瘤菌(Rhizobiumsp.)LD1616对乙草胺的降解率达到0％。这一结果表明，本发明所提供的根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47CGMCCNo.9867可降解乙草胺。实施例3、根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47CGMCCNo.9867降解杂草焚能力定量测定一、杂草焚测定标准曲线的绘制准确称取杂草焚标准品(Fluka公司产品)10.0mg于10mL容量瓶中，用少量甲醇溶解，将容量瓶放在超声波浴槽中振荡10min，然后用甲醇定容至10mL，摇匀，配成1000mg/L杂草焚母液。然后用甲醇稀释获得浓度分别为10、20、40、60、80、100mg/L标准溶液。采用高效液相色谱(HPLC)测定不同浓度杂草焚标准品的峰面积，3次重复。以杂草焚浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制杂草焚标准曲线，如图2所示。检测条件如下：检测系统：Agilent1100Series。色谱柱：C18DiamosilTM反相柱，250mm×4.6mm，粒径5μm。色谱条件：流动相：乙腈：水(冰乙酸调pH3.0)＝40:60(v/v)；检测波长，258nm；流速，1.0mL/min；进样体积，10μL；柱温30℃。所得杂草焚测定标准曲线：y＝7.3196x+2.1212(R2＝0.9875)。其中，y为峰面积，x为杂草焚浓度。二、根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47CGMCCNo.9867降解杂草焚能力定量测定根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47处理：在试管中准确加入5mL含杂草焚100mg/L的无机盐培养基(向无机盐液体培养基中加入杂草焚使杂草焚的浓度为100mg/L得到的培养基)，再加入0.2ml的OD600值为1.0的根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47CGMCCNo.9867菌液(1×109cfu/ml)，28℃、200r/min培养7天，得到降解液。取4mL降解液至50mL离心管中，加入4mL乙腈，振荡2min，静置10min，加入少许无水硫酸钠。准确吸取800μL有机相转移至1.5mLEP离心管中，在氮吹仪上吹干，加入400μL甲醇(色谱级)，在超声波作用下使杂草焚完全溶解，用液谱过滤器过滤收集至样品瓶中，按照上述HPLC法测定杂草焚。根瘤菌(Rhizobiumsp.)LD1616处理：除将上述根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47处理中的根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47CGMCCNo.9867替换为根瘤菌(Rhizobiumsp.)LD1616CGMCCNo.7775，其余均相同。空白对照处理：同时，以未接种根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47CGMCCNo.9867的上述含杂草焚100mg/L的无机盐液体培养基作为空白对照，按照上述方法测定杂草焚的浓度。杂草焚降解率：X＝(1-A/B)×100％，式中X为降解率(％)，A为根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47处理液中残留的杂草焚浓度或根瘤菌(Rhizobiumsp.)LD1616处理液中残留的杂草焚浓度，B为未接菌空白对照处理液中残留的杂草焚浓度。实验设3次重复，每次重复每个处理接种10个试管。测定结果如表4所示。结果显示，杂草焚初始浓度为100mg/L，7天后所述根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47CGMCCNo.9867对杂草焚的降解率9.04％；根瘤菌(Rhizobiumsp.)LD1616对杂草焚的降解率为0.02％(如表4所示)。这一结果表明，本发明所提供的根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47CGMCCNo.9867可降解杂草焚。表4.根瘤菌(Rhizobiumsp.)198-R-47CGMCCNo.9867降解杂草焚功效<110>中国农业科学院农业资源与农业区划研究所<120>一株降解除草剂乙草胺和杂草焚的细菌<160>1<170>PatentInversion3.5<210>1<211>1300<212>DNA<213>根瘤菌(Rhizobiumsp.)<400>1cagacgggtgagtaacgcgtgggaatctacccatctctgcggaatagctctgggaaactg60gaattaataccgcatacgccctacgggggaaagatttatcggggatggatgagcccgcgt120tggattagctagttggtggggtaaaggcctaccaaggcgacgatccatagctggtctgag180aggatgatcagccacattgggactgagacacggcccaaactcctacgggaggcagcagtg240gggaatattggacaatgggcgcaagcctgatccagccatgccgcgtgagtgatgaaggcc300ttagggttgtaaagctctttcaccgatgaagataatgacggtagtcggagaagaagcccc360ggctaacttcgtgccagcagccgcggtaatacgaagggggctagcgttgttcggaattac420tgggcgtaaagcgcacgtaggcggatatttaagtcaggggtgaaatcccgcagctcaact480gcggaactgcctttgatactgggtatcttgagtatggaagaggtaagtggaattccgagt540gtagaggtgaaattcgtagatattcggaggaacaccagtggcgaaggcggcttactggtc600cattactgacgctgaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagt660ccacgccgtaaacgatgaatgttagccgtcgggcagtatactgttcggtggcgcagctaa720cgcattaaacattccgcctggggagtacggtcgcaagattaaaactcaaaggaattgacg780ggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgcagaaccttacc840agctcttgacattcggggtatgggcattggagacgatgtccttcagttaggctggcccca900gaacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgca960acgagcgcaaccctcgcccttagttgccagcatttagttgggcactctaaggggactgcc1020ggtgataagccgagaggaaggtggggatgacgtcaagtcctcatggcccttacgggctgg1080gctacacacgtgctacaatggtggtgacagtgggcagcgagacagcgatgtcgagctaat1140ctccaaaagccatctcagttcggattgcactctgcaactcgagtgcatgaagttggaatc1200gctagtaatcgcagatcagcatgctgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgc1260ccgtcacaccatgggagttggttttacccgaaggtagtgc1300当前第1页1 2 3