金橙II降解菌AO7‑2及其生产的菌剂的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及金橙II降解菌AO7-2及其生产的菌剂，是利用微生物的方法降解偶氮染料金橙II，适用于环境污染的治理。

背景技术：

偶氮染料（偶氮基两端连接芳基的一类化合物）是纺织品服装在印染工艺中应用最广泛的一类合成染料，用于多种天然和合成纤维的染色和印花，也用于油漆、塑料、橡胶等的着色。在特殊条件下，它能分解产生20多种致癌芳香胺，经过活化作用改变人体的DNA结构引起病变和诱发癌症。

偶氮化合物共同的特征为分子中含有偶氮键“-N=N-”。一般来说，偶氮化合物的分子中含有1-3个“-N=N-”，键上连有笨或苯基，苯或苯基又连有-Cl、-NH₂、-CH₃、-SO₃、-NO₂及-OH等基团。

偶氮染料污染的主要特点是污染量大，虽然偶氮染料废水中残留的染料成分浓度很低，但是排入水体会造成水体的透光率降低，破坏水体生态系统。这些染料结构稳定，具有抗碱、抗酸、抗微生物、抗光等特性，可以较长时间地滞留在环境中，因此存在潜在的健康危害。在生产和使用染料的地方，地下水和地表水的重要污染物就是偶氮染料。在很多染料工业密集的地区，河流和地下水都面临着严重污染的危险。

偶氮染料对人体的健康也有严重危害。日本人Yoshida等在20世纪30年代发现，溶剂黄可以引起老鼠肝细胞癌变。此后，人们才开始意识到，在生产和使用过程中，偶氮染料及其中间体具有危险性。芳香胺作为偶氮染料中间体，已被一些国家列为可疑致癌物，其中β-萘胺和联苯胺已经被确认为是对人类最具烈性的致癌物。其中，偶氮基经常会与一个或多个芳香环系统相连，而形成共轭体系，从而作为染料的发色体。他几乎分布于所有颜色。偶氮染料不仅仅可以用于纺织品的印染，还可以用来染纸张、皮革、食品等。应该指出的是，在一般情况下，偶氮染料自身不会危害人体健康，但是部分偶氮染料使用芳香胺类中间体合成的，而芳香胺类中间体具有致癌性，当人体皮肤长时间与其接触后，通过人体正常的新陈代谢过程而释放出的物质就会与其结合，结合后会发生还原反应，该反应会导致偶氮基断裂，从而再次生成具有致癌性的芳香胺类化合物，假如这些生成的化合物被人体重新吸收，在经过活化作用以后，人体的细胞就会在结构和功能方面发生改变，转变成为人体病变的诱因。这样的结果是，导致癌症的可能性。

偶氮染料金橙II产品可溶于水，偶氮染料金橙II对环境的污染已严重危害着人类的健康，其污染环境的综合治理，未见有比较成熟和稳定高效的技术。金橙II高效降解菌株资源极其匮乏。

技术实现要素：

本发明的目的是：提供一种金橙II降解菌AO7-2及其生产的菌剂，降解菌株AO7-2能够高效地降解金橙II，使其脱色率超过90%，用于相关染料废水生物强化处理及水体或土壤的污染治理，丰富金橙II降解菌株资源库。

本发明的技术解决方案是：金橙II降解菌AO7-2的菌株是Arthrobacter protophormiae，属于微球菌科、节杆菌属，于2016年9月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉市武汉大学，保藏编号：CCTCC M2016502，主要生物学特性：细菌菌体呈球状，分散排列，菌落呈淡黄色，圆形，湿润，有光泽，不透明，表面隆起，边缘整齐，细菌无荚膜，无芽孢，革兰氏染色为阳性，细菌通过裂殖进行繁殖，该细菌为异养型细菌，在生长过程中需要氧气，不需要阳光，接触酶反应阳性，氧化酶反应阴性，该细菌的最适生长温度为30-38ºC，最适环境pH为8.0。

利用金橙II降解菌AO7-2生产菌剂，该菌剂通过以下方法制备而成，其特征在于该方法包括以下步骤：

步骤(1)：用接种环刮取一环金橙II降解菌AO7-2的试管种接种于中，30℃，180rpm振荡培养至对数期；其中，1L发酵培养基中各组分的重量含量为：蛋白胨1%，酵母膏0.5%，氯化钠0.5%，其余去离子水，pH为9.0；

步骤(2)：将步骤（1）培养好的菌种按培养基体积的1%接种入500L种子罐，培养至对数生长期；1L种子罐培养基中各组分的重量含量为：蛋白胨1%，酵母膏0.5%，氯化钠0.5%，其余去离子水，pH为9.0；培养条件是：培养过程中通无菌空气，每分钟通入的无菌空气与培养基体积之比为1:0.6~1.2，搅拌速度为180~240r/min，培养温度为30℃，培养时间为48~60h；

步骤(3)：将步骤（2）的种子液按培养基体积的10%接入生产罐发酵培养；生产罐所用培养基与种子罐培养基相同；培养条件是：培养过程中通无菌空气，每分钟通入的无菌空气与培养基体积之比为1:0.6~1.2，搅拌速度为180~240r/min，培养温度为30℃，培养时间为48~60h；

步骤(4)：生产罐中，当菌体数量达到10亿个/mL以上时发酵结束，发酵完成后培养液出罐，直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂，该液体剂即为菌剂。

本发明的有益效果是：1、降解菌AO7-2能使金橙II的残留量降低90%以上，在短时间内使偶氮染料金橙II得到降解；2、利用金橙II降解菌AO7-2生产菌剂，生产使用成本低，使用方便，去除效果好，适合相关染料废水生物强化处理及水体和土壤的污染治理，对于保护生态环境、保护人类身体健康、提高农产品的附加值具有重要的意义。

附图说明

图1是菌株AO7-2对金橙II的降解进程；

图2是温度对AO7-2降解效率的影响；

图3-1是pH对菌株AO7-2生长的影响；

图3-2是pH对AO7-2降解效率的影响；

图3-3是系列pH条件下菌株AO7-2对染料金橙II的吸附；

图4是盐浓度对AO7-2降解效率的影响；

图5是金属离子对AO7-2降解效率的影响。

具体实施方式

下面结合实施例及其附图对本发明技术方案做进一步的分析，但不能理解为是对技术方案的限制。

金橙II降解菌AO7-2，其菌株是Arthrobacter protophormiae，属于微球菌科、节杆菌属，于2016年9月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉市武汉大学，保藏编号：CCTCC M2016502。

1. 菌株的分离和鉴定：取污染土壤10g，置于100mL的无菌水中，振荡5min，得土壤菌悬液；取5mL的土壤菌悬液，加入到100mL的无机盐培养基[NH₄NO₃ 1g/L, KH₂PO₄ 1.5g/L, K₂HPO₄ 0.5 g/L, NaCl 0.5g/L, MgSO₄·7H2O, 0.2g/L]中，添加金橙II作为碳源，置于30℃，150r/min摇床振荡培养获得富集液；梯度稀释富集液涂布于添加金橙II的培养基平板上，直到获得金橙II的降解菌株；该降解菌命名为AO7-2，进一步纯化并鉴定为Arthrobacter protophormiae；AO7-2菌株主要生物学特性：细菌菌体呈球状，分散排列，菌落呈淡黄色，圆形，湿润，有光泽，不透明，表面隆起，边缘整齐，细菌无荚膜，无芽孢，革兰氏染色为阳性，细菌通过裂殖进行繁殖，该细菌为异养型细菌，在生长过程中需要氧气，不需要阳光，接触酶反应阳性，氧化酶反应阴性，该细菌的最适生长温度为30-38ºC，最适环境pH为8.0；在实验室条件下该菌降解金橙II的降解率达90%以上，该菌可以用发酵工业通用发酵设备进行生产。

2. 实验室生物降解实验

2.1菌株AO7-2对金橙II的降解进程：菌株AO7-2在LB培养基（LB培养基配方：蛋白胨1%、酵母膏0.5%、氯化钠0.5%，）中振荡（30℃，180rpm）培养过夜，次日取菌株种子液加液体LB稀释3倍后加入金橙II母液，使其终浓度为20mg/L；将该降解体系放置于37℃恒温培养箱中静置，并按时间间隔取样（时间间隔为2小时），所取样品置于冰水混合物中保存，待所有样品取完后统一处理；所有样品取完后，经12000rpm，3min离心去除菌体，得到含有尚未被降解脱色的金橙II的上清液；上清液采用紫外可见分光光度计于484nm处测量其光密度值，实验设置3个重复，分别检测吸光度后计算平均值并以此来衡量体系中金橙II的残留量；结果如图1所示：随着时间的延长，菌株AO7-2能够快速使金橙II溶液脱色，24小时内脱色率超过90%，据此判断菌株AO7-2对金橙II具有很好的降解脱色性能。

2.2温度对AO7-2降解效率的影响：温度对微生物生长和代谢具有非常显著的影响，为阐明温度对菌株AO7-2降解金橙II的影响，将菌株过夜培养后建立降解体系（同2.1），将该降解体系平均分成6份，每份设置三个重复；将均分后的混合液分别放置于10℃、20℃、30℃、37℃、50℃、60℃恒温培养箱中，温浴10小时后取出样品，离心，分别测定并计算不同温度下菌株AO7-2对偶氮染料金橙II的降解率（样品处理和检测方法同2.1）；结果如图2所示：低温和高温对菌株降解金橙II均具有显著的抑制作用，30~37℃是菌株降解金橙II的适宜温度范围；温度达到或超过50℃时，菌株对金橙II的降解率极低，几乎不能使其脱色。

2.3 pH对AO7-2降解效率的影响：pH对微生物生长和代谢同样具有非常显著的影响，微生物都具有一个适宜生长和代谢的pH范围，超出这个范围，微生物就不能很好地生长和代谢；为考察pH对菌株AO7-2生长的影响，分别用盐酸或氢氧化钠溶液将液体LB培养基调至pH3~pH10；按1%接种量，接种在LB中过夜培养的AO7-2种子液至20mL系列pH值的LB培养基中，置于30℃，180rpm恒温摇床中振荡培养约6小时后，用紫外可见分光光度计在600nm处测定菌液吸光值，并以OD600值来衡量对应样品的菌体浓度；结果如图3-1所示：图3-1的结果显示菌株在中性偏碱环境下生长良好，菌株生长的适宜pH范围是6~9；偏酸性环境及强碱性环境对菌株的生长具有极强的抑制作用，当pH小于等于5或大于等于10时菌株无法正常生长。

将菌株AO7-2在LB中的过夜培养物等分成8份，12000rpm，3min离心收集菌体，并分别用等体积系列pH值的LB培养液重悬体，加入终浓度为20mg/L的金橙II母液，构建好的降解体系置于37℃恒温培养箱中，温浴10小时后取出样品，计算和分析不同pH条件下菌株对金橙II的降解率（样品处理和检测方法同2.1），以研究pH对菌株AO7-2降解金橙II的影响；结果如图3-2和3-3所示；图3-2显示pH3-5范围内混合液中金橙II的去除率逐步降低；pH6-9时去除率逐步升高，pH10时去除率略有降低；但在偏酸性环境中，菌株AO7-2对金橙II有明显的吸附作用，从图3-3可以看出pH越低，菌株吸附染料的浓度就越大，颜色也就越深；综合混合液中染料残留和菌体吸附情况，判断菌株在偏碱性环境中对金橙II有较好的降解效果，最适pH为9。

2.4盐度对AO7-2降解效率的影响：盐浓度是环境质量评估和污水处理过程中经常考查的重要参数之一，对微生物的生长和代谢有较大影响；为研究盐浓度对菌株AO7-2的生长的影响，按1%接种量，分别接种在LB中过夜培养的AO7-2种子液至20mL含系列盐浓度（0%，0.5%，1%，1.5%，2%，2.5%，3%，3.5%，4%，4.5%）的LB培养基中，置于30℃，180rpm恒温摇床中振荡培养约6小时后，用紫外可见分光光度计在600nm处测定菌液吸光值，并以OD600值来衡量对应样品的菌体浓度；将菌株AO7-2在LB中的过夜培养物等分成10份，12000rpm，3min离心收集菌体，并分别用等体积含系列盐浓度的LB培养液重悬体，加入终浓度为20mg/L的金橙II母液，置于37℃恒温培养箱中，温浴10小时后取出样品，计算和分析不同盐浓度条件下菌株对金橙II的降解率（样品处理和检测方法同2.1），以研究盐浓度对菌株AO7-2降解金橙II的影响；结果如图4所示：随着盐浓度的提高，菌株AO7-2的生长受到显著地抑制，对金橙II的降解率也略有下降，但影响不显著。

2.5金属离子对AO7-2降解效率的影响：金属离子对微生物的生长和代谢有重要影响，对微生物体内的各种金属酶的催化活力也有较大影响；为研究不同金属离子对菌株AO7-2降解染料金橙II的影响，在含有20mg/L金橙II的菌株培养液中加入一系列不同的金属离子（Mg²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、Cu²⁺、Ca²⁺、Zn²⁺、Hg²⁺、Co²⁺、Ag¹⁺、Al³⁺、K¹⁺、Mn²⁺），并分别设置0.1mM、1mM和10mM三个浓度梯度；体系置于37℃恒温培养箱中，温浴10小时后取出样品，计算和分析各浓度下不同金属离子对菌株降解金橙II的相对降解率（样品处理和检测方法同2.1）；结果如图5所示，Mg²⁺、Ca²⁺、Al³⁺、K¹⁺、Mn²⁺等离子对菌株的降解率没有显著影响，而Fe²⁺、Fe³⁺、Co²⁺等在较高浓度时对菌株降解率有一定的抑制作用，随着其浓度的加大抑制作用越来越强；Cu²⁺、Hg²⁺、Ag¹⁺对菌株的降解率有很强的抑制作用；尤其是Hg²⁺，其在低浓度下就对菌株降解金橙II有强烈的抑制作用。

生产实施例1：依以下步骤生产金橙II降解菌AO7-2的菌剂，该菌剂通过以下方法制备而成，其特征在于该方法包括以下步骤：

步骤(1)：用接种环刮取一环金橙II降解菌AO7-2的试管种接种于中，30℃，180rpm振荡培养至对数期；其中，1L发酵培养基中各组分的重量含量为：蛋白胨1%，酵母膏0.5%，氯化钠0.5%，其余去离子水，pH为9.0；

步骤(2)：将步骤（1）培养好的菌种按培养基体积的1%接种入500L种子罐，培养至对数生长期；1L种子罐培养基中各组分的重量含量为：蛋白胨1%，酵母膏0.5%，氯化钠0.5%，其余去离子水，pH为9.0；培养条件是：培养过程中通无菌空气，每分钟通入的无菌空气与培养基体积之比为1:0.6，搅拌速度为180r/min，培养温度为30℃，培养时间为48h；

步骤(3)：将步骤（2）的种子液按培养基体积的10%接入生产罐发酵培养；生产罐所用培养基与种子罐培养基相同；培养条件是：培养过程中通无菌空气，每分钟通入的无菌空气与培养基体积之比为1:0.6，搅拌速度为180r/min，培养温度为30℃，培养时间为48h；

步骤(4)：生产罐中，当菌体数量达到10亿个/mL以上时发酵结束，发酵完成后培养液出罐，直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂，该液体剂即为菌剂。

生产实施例2：依以下步骤生产金橙II降解菌AO7-2的菌剂，该菌剂通过以下方法制备而成，其特征在于该方法包括以下步骤：

步骤(1)：用接种环刮取一环金橙II降解菌AO7-2的试管种接种于中，30℃，180rpm振荡培养至对数期；其中，1L发酵培养基中各组分的重量含量为：蛋白胨1%，酵母膏0.5%，氯化钠0.5%，其余去离子水，pH为9.0；

步骤(2)：将步骤（1）培养好的菌种按培养基体积的1%接种入500L种子罐，培养至对数生长期；1L种子罐培养基中各组分的重量含量为：蛋白胨1%，酵母膏0.5%，氯化钠0.5%，其余去离子水，pH为9.0；培养条件是：培养过程中通无菌空气，每分钟通入的无菌空气与培养基体积之比为1:0.9，搅拌速度为210r/min，培养温度为30℃，培养时间为54h；

步骤(3)：将步骤（2）的种子液按培养基体积的10%接入生产罐发酵培养；生产罐所用培养基与种子罐培养基相同；培养条件是：培养过程中通无菌空气，每分钟通入的无菌空气与培养基体积之比为1:0.9，搅拌速度为210r/min，培养温度为30℃，培养时间为54h；

步骤(4)：生产罐中，当菌体数量达到10亿个/mL以上时发酵结束，发酵完成后培养液出罐，直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂，该液体剂即为菌剂。

生产实施例3：依以下步骤生产金橙II降解菌AO7-2的菌剂，该菌剂通过以下方法制备而成，其特征在于该方法包括以下步骤：

步骤(1)：用接种环刮取一环金橙II降解菌AO7-2的试管种接种于中，30℃，180rpm振荡培养至对数期；其中，1L发酵培养基中各组分的重量含量为：蛋白胨1%，酵母膏0.5%，氯化钠0.5%，其余去离子水，pH为9.0；

步骤(2)：将步骤（1）培养好的菌种按培养基体积的1%接种入500L种子罐，培养至对数生长期；1L种子罐培养基中各组分的重量含量为：蛋白胨1%，酵母膏0.5%，氯化钠0.5%，其余去离子水，pH为9.0；培养条件是：培养过程中通无菌空气，每分钟通入的无菌空气与培养基体积之比为1:1.2，搅拌速度为240r/min，培养温度为30℃，培养时间为60h；

步骤(3)：将步骤（2）的种子液按培养基体积的10%接入生产罐发酵培养；生产罐所用培养基与种子罐培养基相同；培养条件是：培养过程中通无菌空气，每分钟通入的无菌空气与培养基体积之比为1:1.2，搅拌速度为240r/min，培养温度为30℃，培养时间为60h；

步骤(4)：生产罐中，当菌体数量达到10亿个/mL以上时发酵结束，发酵完成后培养液出罐，直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂，该液体剂即为菌剂。

上述实施例1-3所得菌剂降解金橙II效果如下表：

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