一株六溴环十二烷降解菌的筛选及应用的制作方法

本发明属于微生物及其修复六溴环十二烷hbcd污染的应用技术领域。涉及一株hbcd降解菌的筛选方法及其对hbcd降解方法及应用。

背景技术：

六溴环十二烷(hbcd)是一种新型的溴代阻燃剂，由于其阻燃效率高，热稳定性好，所需添加量小，对材料性能影响小及价格便宜等优点，被广泛应用于电子、电器、化工、建筑、交通、纺织、石油和采矿等领域中。hbcd是仅次于pbdes和双酚a的第三大溴代阻燃剂。hbcd主要有三种同分异构体，即α-hbcd，β-hbcd和γ-hbcd。其中，工业产品中γ-hbcd所占比例最高为75～89％，α-hbcd为10～13％，β-hbcd最少一般为<0.5～12％。

hbcd具有高亲脂性、低水溶性、低蒸气压，可沿食物链逐级放大，并可在环境中远距离迁移。土壤，水体，沉积物，大气等不同环境介质中均检测到hbcd的大量存在。hbcd对内分泌系统以及生殖系统具有毒性，同时在达到一定程度后有潜在的致癌性。可见，长期的生产、使用hbcd导致其在环境中的量不断积累，已经对人类健康及环境安全造成了严重威胁。因此，hbcd的降解已经成为全球环保工作者关注的热点问题。而目前，对于hbcd降解的研究相对较少，主要集中在化学降解、光降解、微生物降解以及一些联合降解技术。其中，微生物降解是消除环境中hbcd的重要手段，具有高效、廉价等优点，但目前关于hbcd微生物降解的研究还较少。因此，筛选高效的hbcd降解菌，并对降解菌株的生理生化特性、降解特性等进行研究，能够为受hbcd污染的土壤及水资源修复等研究提供理论依据及技术支持。

技术实现要素：

本发明的目的是解决关于六溴环十二烷的降解问题，提供一种hbcd高效降解菌的筛选及应用。

本发明技术方案

本发明首先提供了一株hbcd高效降解菌株—溶血不动杆菌(acinetobacterhaemolyticusstrainhw-2)，该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号cgmccno.12918，建议分类命名为acinetobacterhaemolyticus。

所述的acinetobacterhaemolyticusstrainhw-2菌株为革兰氏阴性菌，淡黄色，呈表面隆起的乳白色不透明圆形菌落；扫描电镜下该菌为杆状，直径0.5-0.7μm×1-2μm。

上述菌株来源于天津市子牙电子垃圾污染区域土壤中，经过筛选得到。

本发明所述的筛选方法，具体步骤如下：

称取10g受hbcd污染的土壤样品加入到50-100ml经高温灭菌的0.85％的生理盐水中，充分涡旋后，静置10-30分钟，取5ml土壤上清液过0.45μm滤膜，取1ml滤液转接到10mg/lhbcd为唯一碳源的无机盐培养基中，于30℃，150r/min恒温摇床中培养，每周转接一次，使hbcd的最终浓度达到30mg/l，培养3周后，在lb固体培养基上用平板划线法对菌株进行分离纯化，挑选生长较快的优势菌落，反复纯化3次，得到单一纯菌落，转接到液体lb培养基中扩大培养后，提取该菌株全基因，pcr扩增后，进行16rdna测序，将所测序列提交genbank进行分析，鉴定该降解菌株为acinetobacterhaemolyticus。

其中，所述的无机盐培养基的组分包括：1)基础无机盐培养基：na2hpo4·12h2o25.6g/l,kh2po43g/l,(nh4)2so41.77g/l；2)微量元素培养基：hcl200μl/l,caco30.08g/l,fecl3·6h2o0.0774g/l,mncl2·4h2o0.0115g/l,cuso4·5h2o0.00146g/l,cocl2·6h2o0.0013g/l,zno0.004g/l,h3bo30.00124g/l,edtana4·2h2o0.792g/l,mgcl2·6h2o0.1342g/l,na2moo4·2h2o0.0104g/l。该无机盐培养基的ph为7.4。

所述的lb培养基组成包括：10g/l蛋白胨，10g/lnacl，和5g/l酵母浸粉。

本发明同时提供了上述acinetobacterhaemolyticusstrainhw-2在hbcd降解中的应用。

所述的应用是指acinetobacterhaemolyticusstrainhw-2菌在对hbcd的降解中的应用；所述菌株对hbcd具有较好的降解能力，通过单因素实验，得出该菌株对hbcd降解的最优条件为：ph7，35℃，500μg/lhbcd浓度。

研究表明在ph7，35℃，150ml培养基体积，1mg/lhbcd浓度下，90％以上的hbcd可在38天内降解。

本发明所述hbcd降解的具体过程和步骤如下：

一、hbcd的降解

hbcd的降解采用批实验，首先，将扩大培养后的acinetobacterhaemolyticusstrainhw-2菌离心清洗后，用无机盐培养基将其悬浮，以10⁵cells/ml接入250ml含有150ml无机盐培养基的棕色血清瓶中。然后，向150ml无机盐培养液中加入预设定的hbcd。以不接菌的处理作为实验对照。在35±2℃的培养箱中以150rpm/min的转速进行降解培养。在不同的反应时间取样，测定细菌生长量和hbcd含量变化。

二、hbcd降解过程中细菌的生长情况测定

实验仪器为cyflowspace(partec公司，德国)流式细胞仪，光源功率为50mw，发射波长488nm，采用绝对计数来测定微生物细胞数，其线性范围为2×10²～1×10⁵cells/ml，检出限为200cells/ml，绝对计数误差小于5％。荧光染料选用美国invitrogen公司生产的sybrgreeni。染色方法：取培养液1ml于流式细胞仪专用上样管内，加入10μlsybrgreeni，振荡混匀，室温下避光静置15min后上样检测。仪器增益设置为fsc＝700，ssc＝250，fl1＝250，fl3＝700，speed＝3。用超纯水适当稀释样品以保证测定过程中流式细胞仪计数速度小于500cells/s。

三、液相中hbcd萃取方法的建立

hbcd的萃取采用液液萃取方法。从250ml的棕色血清瓶中取1ml的无机盐样品于灭过菌的5ml离心管中，加入1ml二氯甲烷，剧烈涡旋5min，然后4℃，10000rpm离心10min。离心后，包含hbcd的下层二氯甲烷过0.22μm的有机滤膜后，保存在1.5ml棕色气质小瓶内，-20℃冰箱保存待测。该方法回收率为96％～99％，平均回收率>98％。

四、hbcd的检测

hbcd检测采用高相液相色谱—质谱联用hplc-ms(watersapgc/uplcxevotq-s,waters,milford,ma,usa)，液相色谱柱为德国macherey-nagel系列手性色谱柱(200mm×4.0mm×5μm,macherey-nagel,german)。流动相流速为0.4ml/min，柱温为25摄氏度，锥孔电压为12v。流动相a为乙腈/甲醇(85/15)，流动相b为超纯水。流动相a/流动相b为60/40。该方法检出限<5ppb。

本发明的优点和积极效果：

本发明与现有修复方法或技术相比有以下显著优点和有益效果：

(1)本发明首次发现溶血不动杆菌(acinetobacterhaemolyticusstrainhw-2)对hbcd具有较好的降解能力。

(2)该菌株对于水体中hbcd的降解，除了菌种以外不需投加任何化学药品和其它添加物，不会产生二次污染。且操作流程简单，对管理条件要求低，可用于hbcd污染水体的修复。

(3)鉴于hbcd污染的普遍性和多样性，以及当前hbcd微生物降解研究的缺乏，利用高效hbcds降解菌进行hbcd降解具有非常重要的现实意义和应用价值。

附图说明

图1为acinetobacterhaemolyticusstrainhw-2在扫描电镜下的形态。

图2为acinetobacterhaemolyticusstrainhw-2在lb中培养和hbcd降解过程中的流式细胞检测图。

图3为acinetobacterhaemolyticusstrainhw-2的16srdna基因序列系统发育树。

图4为acinetobacterhaemolyticusstrainhw-2对1mg/lhbcd的降解曲线(a)和细菌生长曲线(b)。

图5为acinetobacterhaemolyticusstrainhw-2在不同条件下的降解率。

图6为acinetobacterhaemolyticusstrainhw-2在降解过程中可利用有机碳和胞外蛋白变化

下面通过具体实施例并结合附图，对本发明的技术方案作进一步具体的说明。

具体实施方式

实施例1、acinetobacterhaemolyticusstrainhw-2的筛选

称取5-10g受六溴环十二烷(hbcd)污染的土壤样品加入到50-100ml经高温灭菌的0.85％的生理盐水中，充分涡旋后，静置10-30分钟，取5ml土壤上清液过0.45μm滤膜，取1ml滤液转接到10mg/lhbcd为唯一碳源的无机盐培养基中，于30℃，150r/min恒温摇床中培养，每周转接一次，使hbcd的最终浓度达到30mg/l，培养3周后，在lb固体培养基上用平板划线法对菌株进行分离纯化，挑选生长较快的优势菌落，反复纯化3次，得到单一纯菌落，转接到液体lb培养基中扩大培养后，提取该菌株全基因，pcr扩增后，进行16rdna测序，将所测序列提交genbank进行分析，鉴定该菌株为溶血不动杆菌(acinetobacterhaemolyticus)。

其中，所述无机盐培养基的组分，以及所述lb培养基的组成参见发明内容部分。

实施例2、acinetobacterhaemolyticusstrainhw-2对hbcd的降解

将acinetobacterhaemolyticusstrainhw-2于100ml的液体lb培养基中35℃活化45小时使其达到对数期。将菌株进行离心清洗后，在棕色250ml血清瓶中配制以hbcd为唯一碳源的150ml无机盐培养基。在ph7，将acinetobacterhaemolyticusstrainhw-2菌以1×10⁵cells/ml转接到hbcd的浓度为1mg/l的无机盐培养基中，以不接菌的处理作为实验对照。在35℃的培养箱中以150rpm/min的转速进行降解培养。在不同的反应时间取样，测定细菌生长和hbcd的含量变化。实验结果表明，acinetobacterhaemolyticusstrainhw-2在38时对hbcd的降解率>90％，如图4。

实施例3、acinetobacterhaemolyticusstrainhw-2对hbcd降解的最优条件

采用单因素实验，选定3个因素：ph、温度、hbcd浓度，分别设定5水平，ph(5、6、7、8、9)，温度(20℃、25℃、30℃、35℃、40℃)，hbcd浓度(500μg/l、1000μg/l，μg/l，2000μg/l，5000μg/l，10000ug/l)，优化acinetobacterhaemolyticusstrainhw-2对hbcd的降解条件。每个处理3个重复，降解时间为15天，研究结果发现，acinetobacterhaemolyticusstrainhw-2菌对hbcd最优的降解条件为ph为7，温度35℃，hbcd的浓度为500μg/l。如图5。

实施例4、acinetobacterhaemolyticusstrainhw-2在hbcd降解过程中的代谢产物变化

acinetobacterhaemolyticusstrainhw-2在hbcd降解过程中会利用hbcd合成各种胞外蛋白，同时hbcd会被降解变为可利用碳源。在无添加hbcd的丙酮培养基中，溶解性蛋白和可利用碳源和添加了hbcd的有明显变化。添加hbcd后，可利用碳源和溶解性蛋白存在时间延长。如图6。

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