专利名称：：一种毒死蜱农药降解菌、其菌剂和制备方法
技术领域：
：本发明涉及微生物
技术领域：
，尤其是涉及一种毒死蜱农药降解菌、其菌剂和制备方法。技术背景水果、蔬菜是人们必不可少的生活必需品，农药是果蔬生产过程中防治病虫草害、保证产量质量必不可少的选择。确保果蔬农药残留符合食品卫生标准，涉及每位公民的生命健康，已成为各级政府实施"菜篮子、果篮子"工程的重要内容。同时，随着生活水平的不断提高，"绿色食品、无公害果蔬"日益深入民心，果蔬农药残留亦成为公众关注的焦点之一。在利益驱动、病虫危害、使用者素质等各种因素综合作用下，农药的不科学使用情况普遍严重，并直接导致了果蔬农药残留的严重超标，威胁人们的生命安全与健康，而且对很大程度上影响了我国果蔬出口创汇。国际市场以农药残留为最大的直接切入点，对我国出口果蔬树起严格的"绿色壁垒"。国家出入境检验检疫总局、农业部等部门指出农药残留已成为我国果蔬出口创汇的最主要阻碍因素和"瓶颈"，必须高度重视果蔬农药残留的源头控制及治理新技术研究。果蔬农药残留治理新技术是食品安全生产的关键配套技术。控制农药污染源以及残留治理新技术研究是解决食品中农药残留的基本办法。目前减少农药残留污染的研究大多集中在选用高效低毒低残留化学农药和生物农药、改进剂型及应用技术方面，但是收效甚微。农产品生产过程中农药的使用不可缺少，寻求高效、安全、经济的农产品农药残留处理新技术，解决病虫害防治用药与农药残留的矛盾，巳成为科研工作者亟待解决的具有重大经济和社会意义的重大科研命题。利用微生物降解剂处理农产品，是农药残留控制处理的新领域、新途径，许多发达国家和大公司企业投入巨资以从事农药残留高效降解菌的研究开发。实验室和实际应用研究都表明利用微生物来降解果蔬中的农药残留，可有效提高农产品的品质和经济价值。毒死蜱是近年来使ffl非常广泛的-一种农药，目前还没有发现专门针对毒死蜱农药的降解菌剂。
发明内容本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供--"种新的毒死蜱农药降解菌。本发明另一目的是提供了实现所述毒死蜱农药降解菌的方法。本发明的还有一个目的是提供了使用所述毒死蜱农药降解菌制备菌剂的方法，得到的菌剂可以使毒死蜱等有机磷农药的残留量降低85%以上，具有较高的降解效果，生产和使用成本较低。本发明的技术方案是提供一种毒死蜱农药降解菌，其特征在于所述降解菌为枝孢菌属C/a^^on'M附sp.的Hu-Ol菌株，菌种保藏号为CCTCCM207111，该菌株ITS序列分析的Genebank登陆号为EF405864。所述毒死蜱农药降解菌的制备方法，包括以下步骤菌种采用砂土管保存法保存。将毒死蜱农药降解菌Hll-Ol的菌种在培养皿上活化，接种于试管斜面。按照以下配方配制查彼氏培养基(Czapekmedium):硝酸钠2.0g，氯化钾0.5g，硫酸镁0.5g，磷酸氢二钾l.Og，硫酸铁O.Olg，蔗糖30.0g，蒸馏水lOOOmL。在pH7.0的液体査彼氏培养基中，接入O.lg湿菌体，在28°C，150r/min的摇床中培养1—7d。本发明提供了采用所述毒死蜱农药降解菌制备降解菌剂的方法，包括以下歩骤(1)将毒死蜱农药降解菌Hu-01的菌种在培养皿上活化，接种于试管斜面；(2)将毒死蜱农药降解菌Hu-01的斜面种接种于查彼氏培养基摇瓶中，振荡培养至对数期；(3)将(2)菌种按照8%10%的接种量种入种子罐，培养至对数生长期；(4)将到达对数期种子液按照8%10%的接种量接种入生产罐J—，一v-苕养；(5)培养液经离心取上清得菌液，菌液立即加入保护剂，分装成液体剂型。步骤(3)所述种子罐培养条件为无菌空气的通气量为4560L/min，搅拌速度为200300转/分，温度28"。步骤(3)种子罐所用的培养基配方为NaNO30.2X，K2HPO40.1%，KC10.05%，MgSO40.05%，Fe2(S04)30.001%，蔗糖3%，蛋白胨0.5%。步骤(3)所述种子罐按容积量80免投料，投料完成后在1.1kg/cm3的压力、12rc条件下灭菌，冷却至28'C后备接种。步骤(4)所述生产罐的培养条件是无菌空气的通气量为0.450.60m3/min，搅拌速度为100200转/分，培养温度为2630°C，培养时间为8896小时。步骤(4)所述生产罐所用的培养基配方为NaN030.2%，K2HP040.1%，KC10.05%，MgSO40.05%,Fe2(S04)30.001%，庶糖3%，蛋白胨0.5%。步骤(4)所述生产罐按照投料量容量=0.080.1:1的比例投料，投料后在1.化g/crr^的压力、12rc条件下灭菌，冷却至28'C后，通无菌空气保持无菌状态备接种。步骤(5)所述保护剂组成为氯化钠质量分数为0.7%，甘氨酸质量分数为0.35%，苯甲酸钠质量分数为0.03%，凯松体积分数为0.17076%，甘汕的体积分数为8.37801%。本发明提供一种毒死蜱农药降解菌Hu-Ol,2007年7月20日寄存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，菌种保藏号为CCTCCM207111，经鉴定为枝孢菌属C7a^邵ori鹏sp.。主要生物学特性为菌株在PDA上黑暗培养，菌落榄绿色，反面黑绿色。分生孢子梗不分枝，直立。枝孢01个隔膜，(527)X(22.5)pm。分生孢子顶生或侧生，椭圆形、柠檬形至近球形，淡榄色，无隔膜，一端或两端具孢脐，(48)X(23),。该菌株ITS序列分析的Genebank登陆号为EF405864。使用所述毒死蜱农药残留高效降解菌生产菌剂的工艺歩骤为斜面种一摇瓶种培养一种子罐培养一生产罐培养一包装为液体菌剂。本发明的有益效果是(1)高效降解真菌Hu-Ol能使毒死蜱的残留量降低85%以上，使用该降解真菌菌剂，成功地解决了农产品生产过程中农药的使用与高效、安全、经济的防治病虫害的矛盾，又可生产出无毒无公害的绿色农产品，可以在果蔬的正常生长过程中使用化学农药防治病虫害而保证果蔬中农药残留含量符合绿色食品要求。(2)本发明生产的农药残留高效降解菌剂具有生产成本低，使用方便，降解效果好的优点，适合在全国果蔬生产出口基地或有绿色食品商标标志的地方大面积使用。(3)本发明对促进协调统一病虫害防治用药与食品安全，大规模推广使用果蔬农药微生物处理，生产无公害蔬菜、绿色食品具有重要的意义。具体实施方式下面结合具体实施例来进--步详细说明本发明。实施例1毒死蜱农药降解菌Hu-Ol的制备方法及生长状况测定将毒死蜱农药降解菌HU-Ol的菌种在培养皿上活化，接种于试管斜面。按照以下配方配制査彼氏培养基(Czapekmedium):硝酸钠2.0g，氯化钾0.5g，硫酸镁0.5g，磷酸氢二钾l.Og，硫酸铁O.Olg，蔗糖30.0g，蒸馏水1000mL。在pH7.0的液体查彼氏培养基中，接入0.1g湿菌体，在28'C，150r/min的摇床中培养l-7d。培养时间与降解菌Hu-Ol的生长状况的关系见表1。表1培养吋间对毒死蜱农药降解菌菌丝体干重的影响菌丝体干重(g/50mL)3d4d5d6d7d0.2825±0.0020.3869±0.0020.4520±0.0040.4458±0遠0.4371±0.003注以..匕结果为3次重复平均数。实施例2(1)将毒死蜱农药降解真菌Hu-Ol的菌种在培养皿上活化，并测定降解性能，接种于试管斜面上备用；(2)试管种接种于含250mL査彼氏培养基1000mL摇瓶中，恒温振荡培养至对数期，准备接种种子罐；(3)种子罐100升，投料量80升，培养基配方为NaN030.2%，K2HP040.1%，KC10.05%，MgS040.05%,Fe2(S04)30.001%，蔗糖3%，蛋白胨0.5%，投料完成后l.lkg/cm3的压力下，12rC高压湿热灭菌，冷却至28'C后，将上述培养好的接菌菌种按8%10%接种量接种于100升种子罐，培养至对数生长期，搅拌速度为200300转/分，无菌空气通气量为4560L/min。(4)将到达对数期的种子液按8%10%的接种量投入生产罐培养，生产罐所用培养基成分与种子罐培养基相同。生产罐容量l吨，投料量为0.080.l吨。投料后的生产罐，1.lkg/ci^的压力下，121'C高压湿热灭菌，冷却至28X:后，通无菌空气保持无菌状态备用。接种后的生产罐温度控制在28°C，无菌空气通气量为0.450.60m3/min，搅拌速度为100200转/分，本步骤整个工艺培养流程吋间为8896小时。(5)发酵完成后培养液经12000r/min条件下离心取上清得菌液，菌液立即加入以下保护剂氯化钠质量分数为0.7%，甘氨酸质量分数为0.35%，苯甲酸钠质量分数为0.03%,凯松体积分数为0.17076%,甘油的体积分数为8.37801%，分装成液体剂型。一、在以50mg/L的毒死蜱为唯一碳源的液体培养基中，接种0.2%的生长至对数生长期、保存不同时间的的Hu-Ol菌液，摇床培养24小时后高效液相色谱法检测农药的降解情况，降解率可达85%以上，结果见表2。表2降解菌Hu-Ol对毒死蜱的降解性<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>二、用本发明的菌剂进行田间农药残留降解试验示范。在田间选取未经施用农药的菜心，划分出18个小区，每小区6m2,分别用手提式喷雾器喷施500x、800x、1200x的48%乐斯本乳油，施药量为50kg/667m2，对照和处理相间排列。施药后3天均匀喷施降解菌菌液，每小区0.3L，以清水作对照，喷施菌液l、2、3天后按照五点取样法取植物样测定其农药残留含量，结果如表3。结果表明降解菌液可以有效的去除毒死蜱残留，有很好的降解效果。表3降解菌Hu-Ol田间毒死蜱残留降解试验<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>注表中同行数据(平均值士标准误)具有不同英文字母者表示在0.05水平差异显著(DMRT法)。权利要求1、一种毒死蜱农药降解菌，其特征在于所述降解菌为枝孢菌属Cladosporiumsp.的Hu-01菌株，菌种保藏号为CCTCCM207111，该菌株ITS序列分析的Genebank登陆号为EF405864。2、一种实现权利要求1所述毒死蜱农药降解菌的方法，其特征在于包括以下步骤菌种采用砂土管保存法保存，将毒死蜱农药降解菌Hu-Ol的菌种在培养皿上活化，接种于试管斜面，按照以下配方配制查彼氏培养基硝酸钠2.0g，氯化钾0.5g，硫酸镁0.5g，磷酸氢二钾l.Og，硫酸铁O.Olg，蔗糖30.0g，蒸馏水1000mL，在pH7.0的液体查彼氏培养基中，接入O.lg湿菌体，在28°C，150r/min的摇床中培养l-7d。3、一种采用权利要求1所述毒死蜱农药降解菌制备降解菌剂的方法，其特征在于包括以下步骤(1)将毒死蜱农药降解菌Hu-01的菌种在培养皿上活化，接种于试管斜面；(2)将毒死蜱农药降解菌Hu-01的斜面种接种于査彼氏培养基摇瓶中，振荡培养至对数期；(3)将步骤(2)菌种按照8%10%的接种量种入种子罐，培养至对数生长期；(4)将到达对数期种子液按照8%10%的接种量接种入生产罐培养；(5)培养液经离心取上清得菌液，菌液立即加入保护剂，分装成液体剂型。4、根据权利要求3所述制备降解菌剂的方法，其特征在于步骤(3)所述种子罐培养条件为无菌空气的通气量为4560L/min，搅拌速度为200300转/分，温度28°C。5、根据权利要求3所述制备降解菌剂的方法，其特征在于步骤(3)种子罐所用的培养基配方为NaNO30.2X，K2HPO40.1%，KC10.05%，MgSO40.05%，Fe2(S04)30.001%，蔗糖3%，蛋白胨0.5%。6、根据权利要求3所述制备降解菌剂的方法，其特征在于步骤(3)所述种子罐按容积量80%投料，投料完成后在1.1kg/cr^的压力、12TC条件下灭菌，冷却至28。C后备接种。7、根据权利要求3所述制备降解菌剂的方法，其特征在于步骤(4)所述生产罐的培养条件是无菌空气的通气量为0.450.60m3/min，搅拌速度为100200转/分，培养温度为2630°C，培养时间为8896小时。8、根据权利要求3所述制备降解菌剂的方法，其特征在于步骤(4)所述生产罐所用的培养基配方为NaN030.2%，K2HP040.1。％,KC10.05%，MgS040.05%，Fe2(S04)30.001%，蔗糖3%，蛋白胨0.5%。9、根据权利要求3所述制备降解菌剂的方法，其特征在于步骤(4)所述生产罐按照投料量容量=0.080.1:l的比例投料，投料后在1.化g/cir^的压力、121T条件下灭菌，冷却至28。C后，通无菌空气保持无菌状态备接种。10、根据权利要求3所述制备降解菌剂的方法，其特征在于步骤(5)所述保护剂组成为氯化钠质量分数为0.7%，甘氨酸质量分数为0.35%，苯甲酸钠质量分数为0.03%，凯松体积分数为0.17076%，甘油的体积分数为8.37801%。全文摘要本发明公开了一种毒死蜱农药降解菌，所述降解菌为枝孢菌属Cladosporiumsp.的Hu-01菌株，菌种保藏号为CCTCCM207111，该菌株ITS序列分析的Genebank登陆号为EF405864；本发明同时公开了采用所述降解菌制备菌剂的方法。本发明菌剂生产成本低，使用方便，降解效果好，适合在全国果蔬生产出口基地或有绿色食品商标标志的地方大面积使用，对促进生产无公害蔬菜、绿色食品具有重要的意义。文档编号C12N1/20GK101157901SQ20071003030公开日2008年4月9日申请日期2007年9月18日优先权日2007年9月18日发明者胡美英,钟国华,燕高申请人:华南农业大学